调节性 T 细胞在结直肠癌免疫治疗中的意义

党利敏 马虎林

结直肠癌目前在全球癌症发病率中排名第三,在癌症相关死亡中排名第二,2020年全球结直肠癌新发病例1 931 590例,死亡935 173例,分别占癌症发病和死亡总数的10.0%和9.4%[1]。化疗联合或不联合靶向治疗是转移性结直肠癌(mCRC)的基本治疗方法。由于化疗药物的不良反应和肿瘤细胞的生物学特性,传统策略难以突破。了解肿瘤微环境(TME)中癌细胞和免疫细胞之间的相互作用是癌症免疫治疗的关键所在。癌症发展过程中癌细胞与免疫系统之间的相互作用被概括为“癌症免疫编辑”假说,由免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸三阶段组成[2]。免疫抑制机制为肿瘤细胞早期的无序性生长提供了先决条件,而调节性T细胞(Treg)在此机制中发挥着不可替代的作用。虽然 Treg 细胞对于维持免疫稳态至关重要,但它们在抑制癌症免疫中的抗肿瘤免疫反应方面也起着核心作用。因此可通过耗竭Treg细胞来增加癌症免疫疗法的效果[3]。尽管已经对 Treg 细胞靶向治疗的疗效进行了临床前试验及临床实验,但 Treg 细胞耗竭引起的自身免疫性疾病仍然不容忽视[4-5]。Treg 细胞耗竭不仅会导致肿瘤浸润部位 Treg 细胞的丢失,还会导致外周 Treg 细胞的丢失,这可能会损害对自身抗原的免疫耐受性,从而导致自身免疫性疾病的发生。因此,最佳的 Treg 细胞靶向免疫疗法应选择性地从 TME 中去除 Treg 细胞,同时保留外周 Treg 细胞,以预防自身免疫性疾病。随着免疫检查点阻断(ICB)治疗研究的深入,结直肠癌免疫耐药机制逐渐明朗,新的预测性生物标志物不断涌现。目前正在积极开展检查免疫检查点效果的临床试验,以期对 mCRC 患者产生持久效果。基因改变,例如癌细胞中的驱动基因改变,通过影响细胞因子/趋化因子环境和代谢微环境来募集和激活免疫抑制细胞,从而调节 TME 中的免疫反应[3]。因此,阐明癌细胞中的基因改变与癌症患者个体的免疫反应之间的关系可能有助于“免疫精准医学”的发展,“免疫精准医学”目前在分子靶向治疗领域不断发展,并可扩展至癌症免疫治疗。本文通过总结Treg细胞的功能和表型,探讨基于Treg细胞靶向治疗结直肠癌的“免疫精准医疗”的发展。

1 TME中的 Treg 细胞

1.1 Treg 细胞的特征 Treg 细胞最初被认定为 CD4+T 细胞中的胸腺来源的免疫抑制细胞,在小鼠中具有高表达的 CD25 [白细胞介素 (IL)-2 受体 α 链][5],后来在人类中得以发现。叉头转录因子(Foxp3)是叉头转录因子的一个亚家族成员,是Treg细胞最关键的细胞内标志物,也是Treg 细胞的主要调节因子[6-7]。目前,Treg细胞根据其发育部位分为天然调节性T细胞和外周诱导的调节性T细胞[8-10]。研究发现,相比正常结肠组织,肿瘤浸润组织中Treg细胞明显增多,且与肿瘤的TNM分期呈正相关,同时肿瘤组织CD4+T细胞中Foxp3、IL-10、TGF-β1的mRNA表达水平明显升高[11],然而,外周诱导的 Treg 细胞的体内功能和稳定性尚不清楚,尤其是在人类中。此外,人类 CD4+Foxp3+T 细胞在功能和表型上存在异质性,因为常规 CD4+T细胞在 TCR 刺激后瞬时表达 Foxp3[12-13],尽管Treg 细胞可被鉴定为表达 Foxp3 的 CD4+小鼠中的 T 细胞。因此,有必要将人类的 Treg 细胞与表达 Foxp3 的常规 T 细胞区分开来。根据 CD4、CD45RA、CD25 和(或)Foxp3的表达,人类表达 Foxp3 的 CD4+T 细胞可分为幼稚/静息 Treg 细胞、效应/活化 Treg (eTreg) 细胞以及非Treg细胞。Foxp3+T 细胞很容易通过 TCR 刺激从常规 T 细胞中诱导出来,但这类细胞仅产生炎性细胞因子而不具备免疫抑制功能;然而,某些细胞因子或特定的微生物群会从 CD4+CD25-T 细胞诱导出具有免疫抑制功能的 Treg 细胞。相反,非 Treg 细胞不具备免疫抑制功能,而是产生炎性细胞因子,包括干扰素 (IFN)-γ 和 IL-17等[14-15]。

1.2 Treg 细胞的免疫抑制 Treg 细胞的免疫抑制功能通过多种机制介导,包括共刺激信号的下调[16],IL-2 的消耗,分泌免疫抑制细胞因子(例如 IL-10 和 IL-35)[17]以及免疫抑制代谢物的产生。CTLA-4 对于 Treg 细胞抑制至关重要,它可以避免异常的自身免疫反应并防止免疫反应的过度激活以保护宿主免受自身免疫攻击[18]。树突状细胞(DC)与活化的eTreg细胞表达的CTLA-4结合,从而降低APC的CD80/86表达,阻碍APC的成熟、下调APC上CD80/86的表达[19]。IL-2 是效应 T 细胞(包括 CD8+T 细胞)激活和存活所必需的。高亲和力 IL-2 受体由3个亚基组成:α 链、β链和γ链,分别对应CD25、CD122和CD132,大多数Treg 细胞表达高亲和力CD25,因为 IL-2 受体信号对于 Treg 细胞功能维持及Foxp3 的诱导是不可或缺的[20]。Treg 细胞主要通过高亲和力 IL-2 受体消耗 IL-2,几乎不产生 IL-2,从而限制了TME中 IL-2 的数量。因此,效应T细胞由于缺乏对其激活至关重要的IL-2而变得功能失调。IL-10和IL-35通过下调APC上主要组织相容性复合体(MHC)和共刺激分子的表达抑制效应T细胞的功能和增殖[21]。Treg 细胞抑制抗肿瘤免疫反应,特别是肿瘤抗原特异性效应 T 细胞反应。Treg 细胞在某些化学因子的趋化下聚集于TME中,在局部增殖分化成一个激活的亚群,强烈抑制肿瘤抗原特异性效应 T 细胞的激活和扩增[22]。值得注意的是, TME 中的Treg 细胞比例的增高和效应 T 细胞(如 CD8+T 细胞)的增多与各种类型癌症患者的不良预后相关(包括黑色素瘤、非小细胞癌、胃癌和卵巢癌)[10,23]。但在结直肠癌中,肿瘤浸润性 Foxp3+T 细胞的预后价值仍存在争议。然而,非 Treg 细胞的 Foxp3 低表达可能会误导只针对Foxp3 表达的分析,因为人类 Foxp3+T 细胞同时包含 eTreg 细胞和非 Treg 细胞[3]。一些结直肠癌患者在 TME 中蓄积了较多 Foxp3+非 Treg 细胞,并伴有高水平的炎症细胞因子,包括肿瘤坏死因子 (TNF)、转化生长因子 (TGF)-β 和 IL-12,它们与良好的预后相关。与此同时,TME 中存在大量真正的 Treg 细胞,尤其是 eTreg 细胞,与不良预后相关,一些患者中几乎检测不到 Foxp3+非 Treg细胞,对上述其他类型癌的研究中也证实了这一点[24]。除此之外,一些报告观点指出,颗粒酶依赖性靶细胞杀伤是 Treg细胞介导的免疫抑制的另一种机制,此机制通过颗粒酶和穿孔素的分泌,介导自然杀伤细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)进行细胞溶解[25]。

Treg 细胞以抗原特异性方式在 TME 中扩增,并具有不同于一般 CD4+T 细胞的 T 细胞受体 (TCR) 库[26]。此外,最近研究表明,TME 中存在大量高度活化的和具有分化表型的 Treg 细胞[27]。Treg细胞通过缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的功能强烈抑制抗肿瘤免疫反应。在代谢方面,抗肿瘤免疫细胞CD8+T 细胞主要采用糖酵解途径进行激活,癌细胞消耗葡萄糖可降低TME中的血糖水平(Warburg 效应),从而阻碍CD8+T 细胞激活进程[28]。同时,Treg 细胞在 TME 中处理丰富的乳酸[29]和脂肪酸[30]进行增殖并发挥其免疫抑制功能。在葡萄糖代谢升高的 TME 中,例如在肝转移病灶,Treg 细胞被大量乳酸激活。因此,Treg 细胞获得高 PD-1 表达,并被抗 PD-1 mAb 治疗进一步激活,导致对 PD-1/PD-L1 阻断疗法产生耐药性[31]。

1.3 Treg 细胞的激活/分化 TME 中 Treg 细胞的激活/分化已通过在单细胞水平上对分子表达进行多项综合分析得到解决。ScRNAseq 分析表明,人类肿瘤浸润性 Treg 细胞高度表达TNFRSF9,并且SOX4、HIVEP1和IRF4被确定为有助于表达 TNFRSF9 的 Treg 细胞发育的转录因子[32]。此外,与黑色素瘤患者的CD8+T细胞和传统CD4+T细胞相比,Treg细胞中趋化因子受体8(CCR8)、TNFRSF1B、TNFRSF18和TNFRSF4的基因表达水平更高[33]。而高频率表达IL10、IKZF3和LAG3的 CD38+Treg 细胞与结直肠癌患者的不良预后相关[34]。通过一系列单细胞基因表达和表观基因组分析,已经证明转录因子 BATF 对于非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者 TME 中 Treg 细胞的激活/分化至关重要[27]。其他转录因子(如 NR4A1 和 IRF4)对 Treg 细胞的激活和分化同样重要,以上二者与BATF共同作用,在肿瘤浸润的 eTreg 细胞中发挥“超级增强子”[35]的作用。

2 Treg 细胞与ICB

2.1 Treg 细胞靶向癌症免疫疗法 鉴于 Treg 细胞作为抗肿瘤免疫的免疫抑制剂的重要作用,各种 Treg 细胞靶向免疫疗法已经在临床前和临床研究中进行了测试[36]。使用抗 CD25 抗体的 Treg 细胞靶向免疫疗法的疗效因癌症类型的不同而有所差异。此外,改变抗CD25抗体的亚类可以进一步增强抗肿瘤作用。如使用鼠的IgG2a 和 κ 恒定区替换原始 αCD25 的恒定区,可以增强抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 活性,并有效消除小鼠中的肿瘤浸润 Treg 细胞[37]。虽然 Treg 细胞耗竭或调节 Treg 细胞的免疫抑制是增强潜在抗肿瘤免疫力的有前途的策略,但 Treg 细胞靶向免疫疗法可能并非对所有肿瘤都有效。对Treg细胞生存和生长至关重要的肿瘤需要通过生物标志物来定义。此外,全身性Treg细胞耗竭可能会增加免疫相关不良事件(irAE)的风险,如自身免疫[38]。为确保 Treg 细胞靶向免疫疗法的安全性,应采用 TME 中的选择性 eTreg 细胞耗竭而非全身性 Treg 细胞耗竭,以提高抗肿瘤功效而,避免诱导有害的 irAE。为此,目前已经使用全面的转录组和蛋白质表达测定,特别是在单细胞水平上,对TME中Treg细胞具有选择性表达模式的一些分子进行了广泛的检测。例如,趋化因子受体4(CCR4)由eTreg细胞选择性表达;因此,抗CCR4抗体可以通过单独消耗eTreg细胞的同时保留幼稚的Treg细胞来激活肿瘤抗原特异性CD8+T细胞[39]。此外,其他分子(如 CCR8 和 GARP)已从肿瘤浸润淋巴细胞的批量和单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 中被鉴定为肿瘤浸润 Treg 细胞的特异性标记,从而为新型 Treg 细胞免疫疗法靶向药物的开发奠定基础[40-41]。目前Treg被认为是实现放疗成功的重大障碍,因此建议将基于Treg细胞的免疫疗法与放疗结合使用,以实现最大的治疗效果。

2.2 Treg 细胞耗竭与ICB ICB治疗可以通过针对肿瘤引起的免疫缺陷来激活肿瘤病灶的免疫反应并修复现有的免疫反应。该疗法下的患者可能会获得持久疗效,但长期疗效受限于治疗过程中出现的耐药机制。如在PD-1阻断治疗中,Treg细胞的生存和增殖功能依赖于TCR和CD28信号分子,故而PD-1阻断可能激活Treg细胞的免疫抑制功能。同样,PD-1 缺陷的 Treg 细胞具有很强的免疫抑制活性,以保护自身免疫表型[42],并且抑制 PD-1/PD-L1 信号传导会导致早期 Treg 细胞动员的增加,从而抑制感染引起的急性炎症。有研究表明,在一些进行抗 PD-1 mAb 治疗的胃癌患者中,Treg 细胞介导的免疫抑制活性增强,从而导致 PD-1 阻断治疗期间病情的过度进展[43]。TME中的效应T细胞和Treg细胞表达PD-1的平衡与PD-1/PD-L1阻断疗法的疗效密切相关,从而成为预测PD-1/PD疗效的生物标志物。此外,抗 GITR 抗体、抗 4-1BB 抗体或抗 GARP 抗体与抗 PD-1 抗体联合消除 Treg 细胞可增强抗肿瘤免疫反应的效果[44]。几种影响Treg 细胞存活和功能的关键信号分子(如PI3K、c-Rel和LCK )抑制剂可增强抗肿瘤免疫反应[45]。例如,PI3K 抑制剂通过选择性耗竭Treg 细胞来增加具备肿瘤抗原特异性记忆 CD8+T 细胞的数量[46]。另一份报告表明,CARMA1-BCL10-MALT1 (CBM) 信号体复合物的功能障碍可通过将 Treg 细胞功能从免疫抑制改变为免疫激活来改善 PD-1 阻断的临床效果[47]。总而言之,Treg 细胞靶向免疫疗法不仅具有作为单一疗法的潜力,而且还具有与 ICI (免疫检查点抑制剂)联合使用的潜力,包括 PD-1/PD-L1 阻断疗法。通过对肿瘤浸润性Tregs进行的单细胞 RNA 测序,发现2个主要的肿瘤浸润性Tregs亚群,其中CCR8与 Treg 激活标记物结合的独特表达为高选择性生物标记物的靶向治疗提供了可能。使用新生成的抗CCR8纳米抗体-Fc融合体选择性耗竭 CCR8+调节性T细胞,可导致肿瘤生长显著减缓,并表现出与抗PD-1疗法协同的作用,从而提高抗肿瘤免疫的有效性和安全性[47]。同时也有研究显示,CCR8+Treg的耗竭诱导了强效且更不易耗竭的CD4+和CD8+效应T细胞,上调CD80/CD86在抗原呈递细胞(APC)上的表达,促进肿瘤抗原特异性效应/记忆CD8+T细胞的形成[48]。使用细胞消耗型抗 CCR8 单克隆抗体 (mAb) 选择性地消除了多克隆肿瘤 Tregs,激发了抗肿瘤免疫反应,从而治愈了小鼠体内已形成的肿瘤,并且不会引发有害的自身免疫反应或免疫疾病。总之,研究证实 CCR8 是肿瘤组织中克隆性扩展 Tregs的标志物,抗 CCR8 mAb 治疗在短期内选择性消除此类多克隆 Tregs,可激发并维持较强的抗肿瘤免疫反应[49]。

2.3 TME中的T细胞抑制与ICB的耐药 TME 中的几种因素会共同作用抑制免疫功能,包括Treg、IL-10、肿瘤相关巨噬细胞 (TAM)、髓源性抑制细胞 (MDSC) 和相关细胞因子,这些因素均会影响 ICB 疗效以及导致耐药性的产生[50]。当 TME 中存在某些特定的非肿瘤细胞 (NTC) 时,尽管有足够的 CD8+T 细胞浸润和 IFN-γ 反应,但 ICB 仍会出现治疗耐药性。具有调节局部免疫功能能力的Tregs和MDSCs被认为是NTCs的代表。当 Treg 或 MDSC 存在于 TME 中时,它们会导致针对肿瘤细胞的免疫反应降低。研究表明,TME 中 MDSC 或 Treg 的耗竭可以逆转 ICB 治疗耐药性,肿瘤细胞及其周围基质可以共同调节免疫抑制微环境,从而导致对 ICB 治疗产生耐药性[51-53]。

3 Treg 细胞在 ICI 免疫治疗中的作用

Treg 细胞靶向免疫疗法和 ICI 的组合可以提高治疗效果。抗 CTLA-4 mAb 可作用于 CD4+和 CD8+效应 T 细胞并重新激活其肿瘤免疫功能,然而,据报道,抗 CTLA-4 单克隆抗体的抗肿瘤功效随着抗 CTLA-4 单克隆抗体 Fc 部分的耗尽而终止,这对于通过 ADCC 活性耗尽 Treg 细胞的方法至关重要,表明Treg细胞TME 中的耗竭是抗 CTLA-4 mAb 的重要抗肿瘤机制[54]。目前已经成功制备出一种携带新的抗CTLA-4抗体的溶瘤病毒,以增强Treg细胞耗竭的效力[55]。此外,由抗CTLA-4mAb单体和信号调节蛋白α(SIRPα)组成的异二聚体抗体通过阻断SIRPα-CD47信号,增强Treg细胞耗竭效力[56]。因此,抗CTLA-4 mAb的抗肿瘤作用主要是由于其特异的消除了TME中表达CTLA-4的Treg细胞。

4 TME中癌基因的改变与Treg细胞的调节

新抗原是由肿瘤细胞突变基因编码的新抗原,是一种主要由基因点突变、缺失突变和基因融合产生的异常肽。其结构不同于正常细胞表达的结构[57]。在抗肿瘤免疫的压力下,肿瘤抗原减少或丢失。这个过程被称为抗原调节,使肿瘤细胞能够逃避免疫识别和杀伤。肿瘤疫苗目前也是研究的一大热点。目的是将肿瘤抗原(包括肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的基因)引入患者体内,增强免疫原性,激活患者自身免疫系统,诱导机体免疫反应,从而控制或消除肿瘤[58]。癌细胞中的基因改变可调节 TME 中的免疫状态。在小鼠癌症(鳞状细胞癌)模型中,粘着斑激酶 (FAK) 通过调节TME中 CCL5 的表达和 CD8+T细胞的耗竭来募集Treg细胞。FAK 抑制剂通过抑制 Treg 细胞募集来增强抗肿瘤免疫反应。在人体中,EGFR(表皮生长因子受体)突变的 NSCLC具有免疫抑制性的 TME(高水平的 Treg 细胞和低水平的 CD8+T 细胞)。NSCLC 细胞增加 CCL22 的表达,吸引 TME 中的 Treg 细胞,而CD8+T 细胞通过抑制 CXCL10 和 CCL5 的产生来减少Treg细胞的浸润。EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制剂)治疗通过抑制 NSCLC 细胞产生 CCL22 来减少 TME 中的 Treg 细胞。抑制 EGFR 信号传导可提高抗 PD-1 抗体在EGFR突变肿瘤动物模型中的治疗效果[59]。在胃癌患者中,与CD8+T 细胞相比,具有RHOA突变的癌细胞(胃癌的驱动基因)产生的游离脂肪酸被 Treg 细胞有效吸收,从而导致 TME 中 Treg 细胞的增加。此外,RHOA突变的癌细胞产生的 CXCL10 和 CXCL11 水平低于正常细胞。富集于TME中的 Treg 细胞在一定程度上削弱了胃癌患者的抗肿瘤免疫反应[60]。因此,在一些致癌驱动突变的癌症中,癌症免疫疗法和调节肿瘤细胞内在信号的分子靶向疗法相结合,可能为癌症免疫疗法有效恢复抗肿瘤免疫反应创造条件。

5 未来与展望

Treg 细胞对维持免疫稳态有很大贡献。在癌症环境中,Treg 细胞还在癌细胞的免疫逃逸中发挥重要作用。因此,Treg 细胞的选择性耗竭增强了多种癌症类型的抗肿瘤免疫反应。然而,通过Treg 细胞耗竭提供抗肿瘤免疫力的有效性仍不能保证,并可能诱发有害的 irAE,因此,迫切需要开发生物标志物,通过分析患者的标本来区分应答者和非应答者,并开发新型的选择性的Treg细胞靶向疗法,而新分子的发现关乎在单细胞水平探索 TME 中 Treg 细胞的最新实验技术。此外,通过控制趋化因子环境和代谢微环境,各种基因改变参与建立免疫抑制性 TME,包括丰富的 Treg 细胞。未来可能会开发出基于癌细胞基因改变的Treg细胞靶向治疗,诱导Treg细胞的激活/分化。