长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18通过微RNA-497-5p/细胞周期蛋白E1轴调节弥漫性大B细胞淋巴瘤的增殖、凋亡和侵袭

廖子龙，向国强，陈绘迦

作者单位：恩施土家族苗族自治州中心医院血液病科，湖北 恩施445000

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种在遗传发现、治疗反应和临床预后方面具有高度异质性的肿瘤［1］。尽管治疗策略的进步，如脂质体多柔比星和利妥昔单抗，大大提高了DLBCL的治疗效果，但总体5年生存率仍较低［2］。因此，进一步研究与DLBCL发病机制有关的治疗靶点可能会为DLBCL的有效治疗提供更多的机会。大量证据显示，长链非编码RNA（lncRNA）失调与肿瘤的进展密切相关［3］。人类白细胞抗原复合体18（HCG18）是一种新发现的lncRNA，已有研究发现，HCG18在胃癌、咽喉癌中高表达，且可促进肿瘤的进展［4-5］。而HCG18对DLBCL细胞恶性生物学行为的影响尚不清楚。此外，lncRNA可以充当ceRNA通过海绵化miRNA来调节基因表达，进而在许多疾病中发挥关键作用［6］。生物信息学分析发现HCG18与微小RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p与细胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）存在结合位点。相关研究显示，过表达miR-497-5p可抑制胰腺癌细胞增殖［7］，CCNE1在DLBCL中发挥致癌作用［8］。而HCG18能否通过调控miR-497-5p/CCNE1轴影响DLBCL恶性进展尚不可知。因此，本研究拟从细胞水平上探究HCG18对DLBCL细胞行为的影响以及对应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 临床样本及细胞 以2018年5月至2021年5月恩施土家族苗族自治州中心医院收集的23例DLBCL病人淋巴组织以及同期本院收治的23例良性淋巴结增生病人的淋巴组织为研究对象。病人或其近亲属已知情同意，本实验符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。

人正常B细胞永生化细胞HMy2.CIR、DLBCL细胞系SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932均购自上海烜雅生物公司。

1.2 主要试剂 CCK-8试剂盒购自杭州昊鑫生物公司（货号HY-K0301），Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自沈阳万类生物公司（货号WLA001），兔源一抗CCNE1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司（货号ab33911、ab32503、ab29、ab8245、ab76003、ab6721）。

1.3 实验分组 将HMy2.CIR、OCI-LY8、SU-DHL-1、U2932细胞在RPMI 1640培养基中培养。取对数生长期的OCI-LY8细胞，分别将过表达物阴性对照（pcDNA）、HCG18过表达物（pcDNA-HCG18）、小干扰RNA阴性对照（si-NC）、HCG18小干扰RNA（si-HCG18）、si-HCG18和抑制物阴性对照（inhibitorNC）、si-HCG18和miR-497-5p 抑制物（miR-497-5p inhibitor）转染于OCI-LY8细胞，并分组为pcDNA组、pcDNA-HCG18组、si-NC组、si-HCG18组、si-HCG18+inhibitorNC组、si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组。另取正常培养的OCI-LY8细胞作为Ct组。转染48 h后收集各组细胞进行实验。

1.4 qRT-PCR检测HCG18、miR-497-5p表达TRIzol试剂提取总RNA，总RNA反转录为cDNA后进行PCR反应。通过2-ΔΔCt法分别以GAPDH、U6为内参计算HCG18、miR-497-5p相对表达量。引物为GAPDH正向5＇-AAAGGGTCATCATCTCTG-3＇，反向5＇-GCTGTTGTCATACTTCTC-3＇，HCG18正向5＇-GCTAGGTCCTCTACTTTCTG-3＇，反向5＇-CAGAAAGTAGAGGACCTAGC-3＇，miR-497-5p正向5'-CCTTCA GCAGCACACTGTGG-3'，反向5'-CAGTGCAGGGTC CGAGGTAT-3'，U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 细胞增殖的检测 将细胞接种在96孔板（1×104个/孔）中，并在37 ℃、5%二氧化碳下培养48 h。然后，去除上清液，使用无血清新鲜培养基以10∶1的比例稀释CCK-8溶液。各孔加入100 µL CCK-8溶液孵育1 h后测量450 nm处的吸光度［D（λ）450nm］。

1.6 细胞凋亡的检测 调节细胞浓度至7×104个/毫升。然后用500 µL结合缓冲液、5 µL Annexin-V-FITC和5 µL PI重悬细胞。在4 ℃下避光孵育15 min，观察细胞凋亡。

1.7 细胞侵袭的检测 将细胞稀释至2×105个/毫升并悬浮到预涂有基质胶的上室中，再向下室加入含12%胎牛血清的RPMI 1640培养基。孵育24 h后，用多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色侵袭的细胞，观察并统计细胞侵袭数。

1.8 PCNA、CCNE1、Bax、MMP-9蛋白的检测RIPA缓冲液提取蛋白。取30 µg蛋白经定量、电泳、转模、封闭处理后，将膜在4 ℃下与一抗PCNA（1∶5 000）、CCNE1（1∶4 000）、Bax（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）、MMP-9（1∶2 000）过夜孵育，再与二抗（1∶5 000）孵育1.5 h。加入ECL观察蛋白印迹，Image J软件统计蛋白表达情况。

1.9 靶向关系验证 分别构建HCG18、CCNE1野生型质粒和突变型质粒，并命名为HCG18-WT、CCNE1-WT、HCG18-MUT、CCNE1-MUT，将HCG18-MUT、HCG18-WT、CCNE1-MUT、CCNE1-WT分别与miR-497-5pmimic或mimic NC共转染于OCI-LY8细胞，48 h后，评估萤光素酶活性变化。

1.10 统计学方法 SPSS 29.0软件用于统计分析，以表示数据。独立样本t检验用于两组间比较，单因素方差分析及事后SNK-q检验用于多组间的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCG18、miR-497-5p表达及CCNE1蛋白表达比较 与良性淋巴结增生病人淋巴组织比较，DLBCL淋巴组织中HCG18、CCNE1蛋白表达升高，miR-497-5p表达降低（P＜0.05），见图1，表1。与HMy2.CIR细胞相比，SU-DHL-1、OCI-LY8、U2932细胞中HCG18表达及CCNE1蛋白表达上调，miR-497-5p表达下调，且HCG18表达及CCNE1蛋白表达量最高，以及miR-497-5p表达量最低的细胞是OCI-LY8细胞，因此，选取OCI-LY8细胞进行转染实验，见图2，表2。

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴组织中的表达/

表1 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在淋巴组织中的表达/

注：DLBCL为弥漫性大B细胞淋巴瘤，HCG18为人类白细胞抗原复合体18，miR-497-5p为微RNA-497-5p，CCNE1为细胞周期蛋白E1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

CCNE1/GAPDH 0.23±0.02 1.45±0.14组别良性淋巴结增生病人淋巴组织DLBCL淋巴组织例数23 23 HCG18 1.00±0.00 2.36±0.15 miR-497-5p 1.00±0.00 0.18±0.02 41.37＜0.001 t值P值43.48＜0.001 196.63＜0.001

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8细胞中的表达/

表2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8细胞中的表达/

注：HCG18为人类白细胞抗原复合体18，miR-497-5p为微RNA-497-5p，CCNE1为细胞周期蛋白E1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。①与HMy2.CIR细胞比较，P＜0.05。

CCNE1/GAPDH 0.29±0.02 1.42±0.13①1.08±0.09①0.87±0.07①178.20＜0.001组别HMy2.CIR细胞OCI-LY8细胞SU-DHL-1细胞U2932细胞F值P值例数6 6 6 6 HCG18 1.00±0.00 2.66±0.24①2.01±0.14①1.72±0.09①133.30＜0.001 miR-497-5p 1.00±0.00 0.17±0.01①0.39±0.02①0.56±0.05①989.30＜0.001

图1 蛋白质印迹法检测淋巴组织中CCNE1蛋白表达

图2 蛋白质印迹法检测OCI-LY8细胞中CCNE1蛋白表达

2.2 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8细胞中的表达 与Ct组和pcDNA组对比，pcDNAHCG18组HCG18表达及CCNE1蛋白表达上调，miR-497-5p表达下调（P＜0.05），与si-NC组、Ct组相比，si-HCG18组HCG18、CCNE1蛋白表达下调，miR-497-5p表达上调（P＜0.05），与si-HCG18+inhibitor NC组、si-HCG18组相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组miR-497-5p表达下调，CCNE1蛋白表达上调（P＜0.05），见图3，表3。

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8细胞中的表达/

表3 HCG18、miR-497-5p、CCNE1蛋白在OCI-LY8细胞中的表达/

注：HCG18为人类白细胞抗原复合体18，miR-497-5p为微RNA-497-5p，CCNE1为细胞周期蛋白E1，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Ct为对照，pcDNA为过表达物阴性对照，pcDNA-HCG18为HCG18过表达物，si-NC为小干扰RNA阴性对照，si-HCG18为HCG18小干扰RNA，inhibitorNC为抑制物阴性对照，miR-497-5p inhibitor为miR-497-5p 抑制物。①与Ct组对比，P＜0.05。②与pcDNA组对比，P＜0.05。③与si-NC组对比，P＜0.05。④与si-HCG18组对比，P＜0.05。⑤与si-HCG18+inhibitorNC组对比，P＜0.05。

2.33±0.21①②1.44±0.19 0.45±0.03①③0.44±0.04 0.87±0.08④⑤127.80＜0.001 pcDNA-HCG18组si-NC组si-HCG18组si-HCG18+inhibitorNC组si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组F值P值6 6 6 6 6 1.96±0.23①②1.01±0.01 0.26±0.03①③0.25±0.02 0.26±0.03 298.80＜0.001 0.28±0.02①②1.03±0.02 1.95±0.14①③1.94±0.13 1.21±0.09④⑤314.50＜0.001

图3 蛋白质印迹法检测OCI-LY8细胞中CCNE1蛋白表达

2.3 过表达或沉默HCG18对OCI-LY8细胞增殖的影响 与Ct组和pcDNA组对比，pcDNA-HCG18组OCI-LY8细胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），与Ct组、si-NC组比较，si-HCG18组OCI-LY8细胞D（λ）450nm值降低（P＜0.05），与si-HCG18组、si-HCG18+inhibitor NC组比较，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组OCILY8细胞D（λ）450nm值升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组OCI-LY8细胞增殖、凋亡、侵袭情况比较/

表4 各组OCI-LY8细胞增殖、凋亡、侵袭情况比较/

注：D（λ）450 nm为OCI-LY8细胞450 nm处吸光度，Ct为对照，pcDNA为过表达物阴性对照，pcDNA-HCG18为HCG18过表达物，si-NC为小干扰RNA阴性对照，si-HCG18为HCG18小干扰RNA，inhibitorNC为抑制物阴性对照，miR-497-5p inhibitor为miR-497-5p 抑制物。①与Ct组对比，P＜0.05。②与pcDNA组对比，P＜0.05。③与si-NC组对比，P＜0.05。④与si-HCG18组对比，P＜0.05。⑤与si-HCG18+inhibitorNC组对比，P＜0.05。

侵袭细胞数目/个68.85±5.67 70.23±5.62 115.58±8.42①②69.63±5.72 28.31±2.44①③27.31±2.35 46.65±3.22④⑤207.56＜0.001分组Ct组pcDNA组pcDNA-HCG18组si-NC组si-HCG18组si-HCG18+inhibitorNC组si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组F值P值例数6 6 6 6 6 6 6 D（λ）450 nm值1.06±0.12 1.08±0.11 1.98±0.15①②1.07±0.10 0.36±0.04①③0.34±0.03 0.79±0.07④⑤195.00＜0.001细胞凋亡率/%18.38±1.62 18.46±1.56 9.45±0.28①②18.56±1.66 43.67±3.25①③44.18±3.37 25.58±2.24④⑤44.91＜0.001

2.4 过表达或沉默HCG18对OCI-LY8细胞凋亡的影响 与Ct组、pcDNA组比较，pcDNA-HCG18组OCI-LY8细胞凋亡率降低（P＜0.05），与Ct组、si-NC组比较，si-HCG18组OCI-LY8细胞凋亡率上升（P＜0.05），与si-HCG18+inhibitor NC组、si-HCG18组相比，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组OCI-LY8细胞凋亡率下降（P＜0.05），见图4，表4。

图4 流式细胞术检测OCI-LY8细胞凋亡

2.5 过表达或沉默HCG18影响OCI-LY8细胞侵袭与pcDNA组、Ct组相比，pcDNA-HCG18组OCI-LY8细胞侵袭数目升高（P＜0.05），与Ct组、si-NC组比较，si-HCG18组OCI-LY8细胞侵袭数目降低（P＜0.05），与si-HCG18组、si-HCG18+inhibitor NC组比较，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组OCI-LY8细胞侵袭数目升高（P＜0.05），见图5，表4。

图5 Transwell实验检测OCI-LY8细胞侵袭（结晶紫染色×200）

2.6 过表达或沉默HCG18影响OCI-LY8细胞中蛋白表达 与Ct组和pcDNA组对比，pcDNAHCG18组OCI-LY8细胞中PCNA、MMP-9蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低（P＜0.05），与Ct组和si-NC组对比，si-HCG18组PCNA和MMP-9蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调（P＜0.05），与si-HCG18组、si-HCG18+inhibitor NC组比较，si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组PCNA和MMP-9蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调（P＜0.05），见图6，表5。

表5 各组OCI-LY8细胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表达比较/

表5 各组OCI-LY8细胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表达比较/

注：Bax为Bcl-2相关X蛋白，PCNA为增殖细胞核抗原，MMP-9为基质金属蛋白酶9，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Ct为对照，pcDNA为过表达物阴性对照，pcDNA-HCG18为HCG18过表达物，si-NC为小干扰RNA阴性对照，si-HCG18为HCG18小干扰RNA，inhibitorNC为抑制物阴性对照，miR-497-5p inhibitor为miR-497-5p抑制物。①与Ct组对比，P＜0.05。②与pcDNA组对比，P＜0.05。③与si-NC组对比，P＜0.05。④与si-HCG18组对比，P＜0.05。⑤与si-HCG18+inhibitorNC组对比，P＜0.05。

PCNA/GAPDH 0.71±0.07 0.72±0.06 1.39±0.13①②0.73±0.06 0.22±0.03①③0.23±0.02 Bax/GAPDH 0.35±0.02 0.36±0.03 0.17±0.01①②0.34±0.03 0.94±0.09①③0.95±0.08 MMP-9/GAPDH 0.92±0.07 0.93±0.08 1.72±0.16①②0.94±0.06 0.31±0.02①③0.32±0.03 0.71±0.07④⑤204.90＜0.001分组Ct组pcDNA组pcDNA-HCG18组si-NC组si-HCG18组si-HCG18+inhibitor NC组si-HCG18+miR-497-5p inhibitor组F值P值例数6 6 6 6 6 6 6 0.54±0.05④⑤199.73＜0.001 0.57±0.05④⑤207.81＜0.001

图6 蛋白质印迹法检测OCI-LY8细胞中PCNA、Bax、MMP-9蛋白表达

2.7 HCG18靶向调控miR-497-5p/CCNE1轴lncRNA HCG18与miR-497-5p、miR-497-5p与CCNE1存在结合位点，见图7。miR-497-5p mimic和HCG18-WT共转染组的萤光素酶活性低于mimic NC和HCG18-WT共转染组（P＜0.05）。miR-497-5p mimic和CCNE1-WT共转染组的萤光素酶活性低于mimic NC和CCNE1-WT共转染组（P＜0.05），见表6。

表6 各组萤光素酶活性比较/

表6 各组萤光素酶活性比较/

注：mimic NC为模拟物阴性对照，miR-497-5p mimic为微RNA-497-5p模拟物，HCG18-WT为人类白细胞抗原复合体18野生型质粒，HCG18-MUT为人类白细胞抗原复合体18突变型质粒，CCNE1-WT为细胞周期蛋白E1野生型质粒，CCNE1-MUT为细胞周期蛋白E1突变型质粒。

CCNE1-MUT 1.01±0.13 1.00±0.11 0.14 0.888组别mimic NC组miR-497-5p mimic组t值P值例数6 6 HCG18-WT 1.02±0.10 0.26±0.02 18.26＜0.001 HCG18-MUT 1.03±0.14 1.05±0.16 0.23 0.822 CCNE1-WT 1.06±0.17 0.22±0.03 11.92＜0.001

图7 长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18（lncRNA HCG18）与微RNA-497-5p（miR-497-5p）、miR-497-5p与细胞周期蛋白E1（CCNE1）的结合位点图

3 讨论

最近，越来越多的研究开始关注一系列在DLBCL进展中发挥基本生物学作用的lncRNA。如lnc SMAD5-AS1过表达可以通过海绵化miR-135b-5p上调APC表达来抑制体外和体内DLBCL增殖［9］，lncRNA FIRRE通过促进DLBCL中的细胞增殖和减少细胞凋亡而发挥癌基因的作用［10］。此外，各种研究已将HCG18与肿瘤进展联系起来。如HCG18在透明细胞肾细胞癌组织和细胞中高表达，沉默HCG18减弱了透明细胞肾细胞癌细胞活力、迁移和侵袭能力［11］，HCG18可促进肺腺癌中的肿瘤生长［12］。这些结果揭示了HCG18在上述肿瘤中的促癌作用。本研究表明，在DLBCL淋巴组织和DLBCL细胞中HCG18上调表达，并选择了HCG18上调表达最高的OCI-LY8细胞进行后续实验。PCNA是一种重要的复制辅助因子，具有促进细胞增殖的作用［13］，Bax作为一种细胞凋亡调节剂，其缺失会阻止细胞快速凋亡［14］，MMP-9被认为是肿瘤侵袭过程中细胞外基质蛋白水解降解的主要因素［15］。本研究显示，过表达HCG18可促进OCI-LY8细胞中PCNA、MMP-9蛋白表达及细胞增殖、侵袭，抑制Bax蛋白表达及细胞凋亡，而沉默HCG18则影响效果呈相反趋势。提示HCG18在DLBCL中具有致癌作用，沉默HCG18可抑制OCI-LY8细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡。说明HCG18参与调控DLBCL细胞的增殖、凋亡和侵袭。

大量研究证实，lncRNA可以作为miRNA海绵并调控靶 miRNA的表达［16］。本研究通过生物信息学分析及双萤光素酶验证实验证实了miR-497-5p可与HCG18靶向结合。相关研究表明，过表达miR-497-5p可抑制肺鳞状细胞癌进展［17］，下调miR-497-5p促进了肝癌细胞的增殖、侵袭［18］。本研究发现，miR-497-5p在DLBCL组织和细胞中下调表达，过表达HCG18抑制了OCI-LY8细胞中miR-497-5p表达，下调HCG18促进了OCI-LY8细胞中miR-497-5p表达，猜想沉默HCG18抑制OCI-LY8细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡可能是通过上调miR-497-5p表达来实现的。为了验证该假设，本研究在沉默HCG18的同时再用miR-497-5p inhibitor处理OCI-LY8细胞，结果发现，miR-497-5p inhibitor逆转了沉默HCG18对OCI-LY8细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。证明了猜想的正确性。间接证实了HCG18靶向miR-497-5p在DLBCL细胞的增殖、凋亡、侵袭中发挥调节作用。

miRNA可通过与mRNA的3'UTR互补结合来降解mRNA或抑制蛋白质翻译［19］。为了进一步探究相应的分子机制，本研究通过starbase数据库发现CCNE1为miR-497-5p的靶基因。据报道，过表达CCNE1与卵巢癌的不良预后相关［20］，上调CCNE1表达可促进结肠癌细胞增殖、侵袭［21］。表明CCNE1在上述肿瘤中发挥着癌基因的作用。本研究显示，在DLBCL淋巴组织和细胞中CCNE1蛋白上调表达，上调HCG18抑制了OCI-LY8细胞中miR-497-5p表达，促进了CCNE1蛋白表达，而沉默HCG18后则呈相反趋势，且miR-497-5p与CCNE1存在靶向调控关系，证实了沉默HCG18可能通过上调miR-497-5p来抑制CCNE1表达，进而抑制OCI-LY8细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡。阐明HCG18可通过miR-497-5p/CCNE1轴对DLBCL细胞的增殖、凋亡、侵袭起调节作用。

综上所述，沉默HCG18抑制OCI-LY8细胞增殖、侵袭，诱导细胞凋亡可能是通过调控miR-497-5p/CCNE1轴实现的。该研究可能为DLBCL的治疗提供新的靶点。