脐带间充质干细胞移植联合负压封闭引流技术治疗糖尿病足溃疡的疗效观察

王小飞，高素文，张贞

作者单位：邯郸市中心医院，a烧伤整形科，b内分泌二科，c普外六科，河北 邯郸056001

糖尿病是慢性代谢紊乱疾病，常由胰岛素缺乏或胰岛素信号失调引起［1-3］。糖尿病足溃疡（DFU）作为糖尿病晚期的主要并发症，常合并下肢动脉闭塞和（或）感染，具有高致残率、创口迁延不愈的特点［4-5］。目前，临床治疗过程中感染、代谢紊乱以及缺血等导致的伤口愈合缓慢仍为重大挑战。负压封闭引流（VSD）为目前促进创面愈合的有效方法，已广泛应用于DFU病人的治疗［6-7］，但是单独使用疗效仍需提高。脐带间充质干细胞移植（UCMSCs）由于免疫调节剂自我更新以及低免疫原性等优势成为近年来临床研究热点，在体内移植中使用具有较好的有效性及安全性［8-9］。但是目前将其用于治疗DFU的相关研究较少，还需进一步明确其效果。因此，本研究使用UCMSCs联合VSD治疗糖尿病足溃疡并探究其疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2020年5月至2022年5月邯郸市中心医院接收的86例DFU病人，采用随机数字表法分为引流组（43例）和联合组（43例）。其中引流组年龄（62.78±6.35）岁；男25例，女18例；糖尿病病程（10.53±1.15）年；DFU病程（4.12±0.56）月。联合组年龄（63.14±6.42）岁；男28例，女15例；糖尿病病程（10.89±1.21）年；DFU病程（4.35±0.61）月。两组年龄（t=0.89，P=0.378）、性别（χ2=0.44，P=0.506）、糖尿病病程（t=1.41，P=0.16）及DFU病程（t=1.82，P=0.072）比较差异无统计学意义。纳入标准：（1）临床诊断为DFU［10］；（2）符合糖尿病溃疡分级Ⅱ～Ⅳ病人；（3）自愿签署知情同意书病人；（4）患肢创面未累及踝部病人；（5）溃疡大小为2.5 cm×3.0 cm～6.4 cm×7.6 cm的病人。排除标准：（1）合并严重肝肾功能损害病人；（2）合并高渗性昏迷、酮症酸中毒等糖尿病急性并发症病人；（3）足部溃疡为放射性、结核性及癌性病人；（4）不能接受本研究治疗方法病人。本研究经邯郸市中心医院伦理委员会批准（批号20200317）。样本量计算，依据N=［（Zα/2+Zβ）2×σ2］/δ2，Zα/2=1.96，Zβ=1.28，σ=15，δ=10，利用公式计算得样本量为24，本研究纳入86例，每组43例，可进行后续研究。

1.2 方法 两组病人均给予改善微循环、控制血糖等常规治疗。每天进行1次清创换药。引流组：VSD材料（广州市快康医疗器械有限公司，批号：粤械注准20162641544），关闭负压后可冲洗灌注0.9%氯化钠注射液（山东威高药业股份有限公司，批号H20043629）20～50 mL，注射液经引流管流出或充满负压护创材料（在医用透气膜下）关闭冲洗管及引流管，保留注射液30 min后将负压重新启动，每天1次。一般使用6～8 d拆除负压装置，如若生长良好（肉芽组织），直接将创面缝合，若生长较差，继续进行VSD至生长良好，进而缝合创面。

联合组：VSD（同对照组）+UCMSCs：UCMSCs移植剂量及时间节点见表1，结束后每隔2 d进行常规创面处理及换药。

表1 UCMSCs移植剂量及时间节点

UCMSCs制备方法：采集本院妇产科符合标准的脐带标本并在48 h内分离。以弃尽脐带保存液并冲洗2～3次（PBS），移至培养皿中，截取符合标准的2～4 cm小段，剔除脐动脉及脐静脉，再冲洗4～8次（PBS）。经培养皿培养、离心、冷冻等方式提取UCMSCs，最后将细胞混悬液装至细胞冻存袋中，以程控降温仪降温后将其转入液氮中长期保存。使用前，在37 ℃恒温水中复苏，恢复至室温方可使用。

流式细胞术UCMSCs表面标志物鉴定：收集P4或P5代细胞，加入胰蛋白酶（0.25%）进行消化处理，时间为3 min，用DMEM低糖培养基终止消化后收集细胞，半径8 cm离心（转速为1 200 r/min）5 min后用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，进行细胞计数并置于EP管中，于各管细胞中加入FITC标记的CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，放置于4 ℃冰箱中孵育30 min，孵育结束后加入磷酸盐缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测UCMSCs表面标志物。

1.3 指标 （1）创面愈合时间及愈合率，第1次清创至完全愈合为创面愈合时间。（原始-未愈合）/原始溃疡创面面积×100%为创面愈合率。（2）足部相关指标，分别于治疗前后以下肢动脉彩色多普勒检查病人足背动脉血管内径、血流速度，以全自动动脉硬化检测仪检测病人踝肱指数（ABI）。（3）周围血管恢复情况，以密歇根神经体征评分（MNSI）评估患足周围血管恢复情况（分别于治疗前后），量表总分最高为10分，＞5分即可诊断为神经病变，见表2。

表2 密歇根神经体征评分（MNSI）评估标准

于治疗后进行CT血管造影（CTA）检查，评估周围血管情况，使用CT扫描仪（Sensation）（64排，0.5 mm层厚，0.6 mm层距，150 Hu阈值）。出发点为髂总动脉分叉处，静脉期（延迟25 s）、动脉期延迟8 s，平均扫描（长度通过病人情况选取）32 s。注射欧乃派克［碘海醇，通用电气药业（上海）有限公司，批号20090811，1.5 mL/kg，4 mL/s］，后注入0.9%氯化钠溶液（适量），数据传输至工作站处理。（4）炎症指标，抽取病人空腹静脉血3 mL（分别于治疗前后），以血细胞分析仪检测病人C反应蛋白（CRP）、白细胞（WBC）、中性粒细胞百分比（NEU%）水平。（5）肾功能，抽取病人空腹静脉血3 mL（分别于治疗前后），以全自动生化分析仪检测病人尿酸、肌酐水平。（6）临床疗效，标准：①临床症状、创面无变化或加重为无效；②临床症状改善，30%＜创面愈合率＜70%，为有效；③临床症状明显改善，创面愈合率≥70%为显效；④临床症状体征消失，创面基本愈合、愈合，为治愈。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件完成对本研究数据分析。周围血管恢复情况、创面愈合时间及创面愈合率、炎症指标及肾功能为计量资料行描述，进行独立样本t（组间）和配对t检验（组内）；临床疗效等计数资料行例（%）描述，进行χ2检验；等级资料比较进行秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCMSCs细胞的鉴定 UCMSCs经流式细胞仪检测，结果显示UCMSCs高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45，符合鉴定标准，可用于接下来的研究。

2.2 创面愈合时间及创面愈合率 相较于引流组，联合组的创面愈合率上升，愈合时间下降（P＜0.05）。见表3。

表3 糖尿病足溃疡（DFU）86例创面愈合时间及创面愈合率/

表3 糖尿病足溃疡（DFU）86例创面愈合时间及创面愈合率/

组别引流组联合组t值P值例数43 43创面愈合时间/d 31.46±3.25 27.34±2.76 6.34＜0.001创面愈合率/%52.78±5.35 68.42±6.95 11.69＜0.001

2.3 足部相关指标 与治疗前比较，两组治疗后足背动脉血管内径、ABI均明显升高（P＜0.05），且与治疗后引流组比较，联合组明显升高（P＜0.05）；两组血流速度均明显降低（P＜0.05），且与治疗后引流组比较，联合组明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 糖尿病足溃疡（DFU）86例足部相关指标/

表4 糖尿病足溃疡（DFU）86例足部相关指标/

注：ABI为踝肱指数。

组别引流组治疗前治疗后t，P值联合组治疗前治疗后t，P值两组比较t，P值例数43足背动脉血管内径/mm血流速度/（cm/s）ABI 1.86±0.17 1.95±0.21 2.18，0.032 52.75±5.32 47.35±4.75 4.96，＜0.001 0.61±0.15 0.87±0.26 5.68，＜0.001 43 0.64±0.17 0.75±0.21 2.67，0.009 2.35，0.020 1.82±0.15 2.10±0.35 4.82，＜0.001 2.41，0.020 52.14±5.26 41.78±4.27 10.03，＜0.001 5.72，＜0.001

2.4 周围血管恢复情况 与治疗前比较，两组治疗后MNSI评分均明显降低，且与治疗后引流组比较，联合组明显降低；治疗后，联合组血管狭窄程度低于治疗前；治疗后，联合组血管狭窄程度低于引流组（均P＜0.05）。见表5。

表5 糖尿病足溃疡（DFU）86例周围血管恢复情况

2.5 炎症指标、肾功能 与治疗前比较，两组治疗后CRP、WBC、NEU%水平均明显降低（P＜0.05），且与治疗后引流组比较，联合组明显降低（P＜0.05）。两组治疗前后尿酸、肌酐水平比差异无统计学意义（P＞0.05），见表6。

表6 糖尿病足溃疡（DFU）86例炎症指标、肾功能/

表6 糖尿病足溃疡（DFU）86例炎症指标、肾功能/

注：WBC为白细胞，CRP为C反应蛋白，NEU为中性粒细胞百分比。

组别引流组治疗前治疗后t，P值联合组治疗前治疗后t，P值两组比较t，P值例数43 WBC/（×109/L）CRP/（mg/L）NEU%尿酸/（mol/L）肌酐/（mol/L）9.45±1.06 7.58±0.79 9.28，＜0.001 41.78±4.25 35.78±3.62 7.05，0.001 69.72±7.02 64.31±6.53 3.70，＜0.001 350.17±36.12 345.46±35.11 0.61，0.541 55.23±5.61 53.37±5.35 1.57，0.119 43 56.74±5.75 54.23±5.98 1.98，0.051 0.70，0.48 9.12±1.01 6.42±0.67 14.61，＜0.001 7.34，＜0.001 42.14±4.31 29.36±3.02 31.42，＜0.001 8.93，＜0.001 70.54±7.11 58.14±5.86 8.82，＜0.001 4.61，＜0.001 354.23±36.41 343.58±35.36 1.38，0.172 0.25，0.81

2.6 临床疗效 联合组总有效率（95.35%）显高于引流组，联合组临床疗效优于引流组（P＜0.05）。见表7。引流组和联合组病人治疗前后典型病例图见图1，联合组治疗前后CTA远端供血情况见图2。

图1 糖尿病足治疗前、治疗25 d后病例情况:A为引流组治疗前;B为引流组治疗25 d后;C为联合组治疗前;D为联合组治疗25 d后

图2 联合组糖尿病足溃疡右侧股动脉CTA远端供血情况：A为治疗前（狭窄，远端供血差）；B为治疗3个月后（支架置入术后，远端供血改善）

表7 糖尿病足溃疡（DFU）86例临床疗效比较/例（%）

3 讨论

DFU病人截肢风险较大，大多DFU截肢病人存活时间不足5年［11-13］。目前，VSD已广泛用于DFU治疗，具有较好的促进创伤愈合效果［14-15］。成体干细胞UCMSCs具有增殖、分化及自我更新能力，可分化为肌细胞、脂肪以及神经细胞等（在相应环境下）［16-17］。毛水红等［18］研究显示，UCMSCs可通过转化为创面愈合所需的细胞、增加血管密度等途径促进创面愈合。但是目前相关研究较少，尚不明确其具体价值。

因此，本研究使用UCMSCs联合VSD治疗DFU，联合组总有效率（95.35%）明显高于引流组（72.09%）；联合组创面愈合率明显高于引流组，创面愈合时间明显低于引流组；与治疗前比较，两组治疗后足背动脉血管内径、ABI均明显升高，且与引流组比较，联合组明显升高；两组血流速度、MNSI评分均明显降低，且与引流组比较，联合组明显降低；联合组血管轻度狭窄程度明显低高于治疗前及同期引流组，引流组治疗前后血管狭窄程度比较差异无统计学意义。提示，UCMSCs联合VSD治疗DFU可有效改善病人症状，促进创面愈合，效果较好。分析其原因，可能是因为VSD中负压环境使分泌物单向引流、冲洗创面采用多侧孔引流管进行，有利于微循环的改善，促进病人创面愈合。而UCMSCs能够在缺血环境下促进血管形成，增加毛细血管密度及血流供应，进而促进创口愈合；还可通过分泌趋化因子及旁分泌因子促进创面；亦可通过强大的抗炎作用及免疫作用分化为角细胞及内皮细胞促进创面愈合。两者联合使用可优势互补，进一步提高整体疗效。

持续的慢性炎症能够降解胶原蛋白，增加蛋白酶活性，破坏创面，抑制组织重塑及细胞增殖，进而影响创面恢复。本研究对病人炎症水平进行探究显示，与治疗前比较，两组治疗后CRP、WBC、NEU%水平均明显降低，且与引流组比较，联合组明显降低。提示，UCMSCs联合VSD可有效减轻炎症反应，可能是因为VSD在负压环境的治疗基础上通过药液滴注对病人创面进行冲洗，使创面生物负荷以及炎症反应缓解，加速创面愈合，进而提高整体疗效。而UCMSCs通过对免疫功能调节进而对炎症反应进行抑制［19］；且MSCs可自行分泌抑炎因子，能够调控相关通路抑制周围炎症因子分泌，利于血管新生，促进皮肤修复及重建，与VSD联合使用可进一步提高抑炎效果。另外，本研究亦显示，两者联合使用并不影响病人肾功能，较为安全。

综上所述，UCMSCs联合VSD治疗DFU疗效显著，可有效减轻炎症反应，改善临床症状，促进创面恢复，效果较好。但是本研究随访时间较短，并不清楚其长期疗效，还需在以后研究中延长随访时间明确其效果。