全反式维甲酸抑制核因子E2相关因子2和血红素加氧酶1加重大鼠肾脏缺血再灌注损伤表达

董毅玲，张文文，闫琰，覃志成

作者单位：山西医科大学第五临床医学院，山西 太原030012

肾脏缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，IRI）是由于肾脏血液供给不足，随后恢复血液灌流后肾脏功能无法恢复正常，造成其功能代谢障碍及结构受损的一种病理状态［1］。在临床上，缺血再灌注损伤是导致急性肾损伤（acute renal injury，AKI）的主要原因之一，其病理生理过程包括氧化应激、炎症、肾小管上皮细胞凋亡、铁死亡等［2-3］。其中缺血再灌注损伤发生的主要原因是氧化应激。目前相关研究发现Nrf2/HO-1信号通路是调节氧化应激的重要因子。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一种基因转录因子，主要通过调控下游抗氧化酶血红素加氧酶1（heme oxygenase1，HO-1）基因影响细胞的氧化状态，从而调节细胞的氧化还原平衡［4］。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）又名视黄酸，是体内维生素A的中间代谢产物之一，ATRA可以抑制Nrf2与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）的结合能力，其抑制作用是迅速、完全且不可逆转的［5-6］。根据此特性，本研究于2020年10月至2022年2月通过以大鼠肾脏IRI为模型，观察ATRA抑制Nrf2、HO-1表达是否会加重肾脏IRI，同时阐明Nrf2/HO-1通路在肾脏IRI中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 24只雄性无特定病原体（SPF）级6～8周龄SD大鼠，体质量范围260～350 g，购于山西省人民医院动物实验中心。采用常规饲养，在禁食12 h后用于本实验，主要试剂：全反式维甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）购于美国Sigma公司，水合氯醛购于阿拉丁试剂有限公司，兔抗大鼠Nrf2抗体、抗HO-1抗体、山羊抗兔IgG抗体购于北京博奥森生物有限公司，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TdT -mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）试剂盒、尿素氮（BUN）试剂盒及血肌酐（Scr）试剂盒均购于南京建成生物公司，组化试剂盒DAB显色剂、PIPA裂解液、PBS缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于武汉塞维尔生物科技有限公司。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 24只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组（sham组）、肾脏缺血再灌注组（Ischemia/reperfusion，I/R组）及全反式维甲酸组（I/R+ATRA组），每组8只。1周前开始对3组大鼠进行腹腔注射，Sham组、I/R组腹腔注射1 mL/kg玉米油，每天1次；将ATRA溶于玉米油中（100 mg/10 mL玉米油），ATRA组腹腔注射溶于玉米油的ATRA（10 mg/kg），每天1次。持续1周以后，3组大鼠分别腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）进行麻醉，待小鼠对刺激无反应时，表明麻醉成功，将其处于仰卧位固定在37 ℃恒温垫上，清洁手术区域后沿腹中线逐层切开各层组织，暴露双侧肾脏，先结扎右侧肾蒂，然后摘除右肾。Sham组不予以夹闭左肾动脉；I/R组：用无创动脉夹夹闭左肾动脉，使左肾缺血，夹闭后看到肾脏颜色变为暗紫色，在缺血期间随时将伤口用纱布覆盖，并补充0.9%氯化钠溶液，缺血45 min后取出血管夹，恢复肾脏血供，当肾脏颜色回至正常颜色时，表明肾脏再灌注成功。I/R+ATRA组：与I/R组实验过程相同，建立肾脏I/R模型。逐层缝合手术切口，整个实验操作过程注意无菌操作，待大鼠清醒后，放入笼中进行饲养。3组大鼠于实验结束24 h后留取各组血液及肾组织标本。

1.2.2 蛋白质印迹法检测肾组织蛋白水平 将切开的肾组织、匀浆珠、RIPA裂解液进行充分研磨，离心后提取上清液及总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，通过沸水浴将蛋白溶液变性后，分别进行电泳、转膜、封闭、加入一抗（Nrf2为1∶1 000，HO-1为1∶1 000）孵育过夜后，加入二抗（按1∶5 000进行稀释）在室温下孵育半小时后，用TBST缓冲液冲洗3次。最后用ECL化学发光法曝光。用Alpha软件分析、定量蛋白质水平，记录数据。

1.2.3 肾组织SOD、MDA检测 取肾组织约50 mg，将其制作成10%匀浆液，根据试剂盒说明书，通过比色法检测肾组织的SOD活性及MDA含量。

1.2.4 肾组织活性氧检测 DHE染色评估肾组织活性氧：将冷冻的肾组织冰冻切片，进行DHE染色，在荧光显微镜（日本尼康）下观察红色荧光。分别测量每张切片中6个视野阳性的累积光密度值（IOD）以及对应的组织像素面积（Area），并计算出活性氧相对表达量即面密度（Areal density）=IOD/Area进行分析，记录数据。

1.2.5 血清Scr、BUN检测 将装有实验大鼠血清的EP管进行离心，取上层血清成分，通过全自动生化分析仪，根据试剂盒说明书，检测肌酐和尿素氮的含量。

1.2.6 组织病理学检查 用石蜡包埋肾脏组织，将大鼠肾组织切片切成3 µm厚，苏木精-伊红（HE）染色处理后，显微镜下观察肾脏病理形态变化。肾小管损伤程度评分：0分，代表正常；1分，代表微创伤（外髓质和皮质破坏＜5%）；2分，代表轻度破坏（外髓质和皮质破坏5%～25%）；3分，代表中度破坏（外髓质和皮质破坏＞25%～75%）；4分，代表严重破坏（外髓质和皮质破坏＞75%）［7］。每张切片至少选8个皮髓交界部视野观察（×200）。

1.2.7 肾脏组织凋亡细胞检测 根据TUNEL染色试剂盒说明书进行操作。每张切片取6个细胞分布不重叠的视野，采集图像。使用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism5软件进行统计并绘图，计量资料以表示，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量比较 与Sham组相比，I/R组大鼠的肾组织Nrf2、HO-1蛋白表达均增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与I/R组相比，I/R+ATRA组Nrf2、HO-1蛋白表达均减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1，表1。

表1 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量/

表1 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量/

注：Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶1。①与Sham组比较，P＜0.01。②与I/R组比较，P＜0.01。

组别Sham组I/R组I/R+ATRA组F值P值HO-1相对表达量0.024±0.007 0.37±0.79①0.15±0.03②106.79＜0.001鼠数8 8 8 Nrf2相对表达量0.06±0.01 0.52±0.09①0.29±0.04②120.62＜0.001

图1 各组大鼠肾组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量

2.2 肾组织SOD、MDA表达 与Sham组比较，I/R组肾组织SOD活性减弱，MDA含量增高（P＜0.05）；与I/R组比较，ATRA处理后的肾组织SOD活性明显下降，MDA含量明显增高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾组织SOD活性和MDA含量比较/

表2 各组大鼠肾组织SOD活性和MDA含量比较/

注：SOD为超氧化歧化酶，MDA为丙二醛。①与Sham组比较，P＜0.05；②与I/R组比较，P＜0.05。

组别Sham组I/R组I/R+ATRA组F值P值MDA/（nmol/mg）15.71±1.73 23.14±2.51①30.47±3.74②56.17＜0.001鼠数8 8 8 SOD/（U/mg）366.92±36.01 281.99±9.96①190.37±11.23②122.92＜0.001

2.3 肾组织活性氧表达 用活性氧荧光探针DHE染色，荧光显微镜下观察发现，相比于Sham组，I/R组肾组织细胞内有微弱的红色荧光，活性氧相对表达量增加（t=7.76，P＜0.001，其中Sham组和I/R组的活性氧相对表达量分别为（0.20±0.04）%和（0.97±0.27）%；与I/R组比较，I/R+ATRA组红色荧光明显增强，活性氧相对表达量（2.14±0.46）%明显增加（F=79.34，P＜0.001）。见图2。

图2 各组大鼠肾组织活性氧表达（DHE染色×200）

2.4 各组大鼠Scr及BUN表达 与Sham组相比，I/R组血清Scr、BUN水平均升高（P＜0.01）；与I/R组相比，I/R+ATRA组血清Scr、BUN含量均明显升高（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清 Scr、BUN 水平比较/

表3 各组大鼠血清 Scr、BUN 水平比较/

注：Scr为肌酐，BUN为尿素氮。①与Sham组比较，P＜0.01。②与I/R组比较，P＜0.01。

组别Sham组I/R组I/R+ATRA组F值P值BUN/（mmol/L）6.36±1.33 16.46±1.37①23.31±1.23②338.21＜0.001鼠数8 8 8 Scr/（µmol/L）74.38±7.57 121.97±13.94①341.48±23.73②597.89＜0.001

2.5 各组大鼠肾脏病理情况比较 Sham组肾小球、肾小管、肾间质结构及组织学正常，肾小管损伤病理评分为（0.75±0.46）分；与Sham组比较，I/R组可见部分肾小管上皮细胞肿胀、变性，间质有炎性细胞浸润，肾小管损伤评分（3.13±0.64）分较高（t=8.50，P＜0.001）；与I/R组相比，I/R+ATRA组病理改变明显加重，肾小管管腔明显水肿、扩大，刷状缘消失，伴大量空泡变性，肾小管间质出现纤维化病变，伴大量炎性细胞浸润，肾小管损伤评分（4.88±0.35）分明显增高（F=137.17，P＜0.001）。见图3。

图3 各组大鼠肾脏病理情况比较（HE染色×200）

2.6 各组大鼠肾组织的细胞凋亡情况 Sham组有微量凋亡细胞表达，凋亡细胞阳性率为（0.48±0.09）%；与Sham组相比，I/R组大鼠肾组织凋亡细胞表达增加（P＜0.05），凋亡细胞阳性率为（1.06±0.26）%；与I/R组比较，I/R+ATRA组凋亡细胞表达明显增加（P＜0.05），其凋亡细胞阳性率为（1.74±0.08）%，差异有统计学意义（F=117.64，P＜0.001），见图4。

图4 各组大鼠肾脏组织凋亡细胞比较（TUNEL染色×200）

3 讨论

急性肾损伤常见的原因是肾脏IRI，肾脏IRI是一种复杂的病理生理事件，而氧化应激是肾脏IRI发生发展的主要病理生理机制［8］。在肾脏缺血再灌注阶段，组织重新获得氧从而产生大量的活性氧，直接造成细胞内抗氧化物质、抗氧化酶数量减少，进而导致氧化-抗氧化能力失衡，加重细胞损伤、坏死［9］。有相关证据表明，减少与肾脏IRI相关的氧化应激有助于改善肾脏功能，提高生存率，缓解肾IRI［10］。

Nrf2作为机体抗氧化应激的重要转录因子，正常情况下，Nrf2主要与其抑制剂Keap1（Kelch-like ech-associated protein 1，Keap1）结合保留在细胞质中，维持低转录活性［11］。在细胞受到亲电试剂或其他活性物质（如活性氧）刺激时，Nrf2与Keap1解耦联，活化的Nrf2从细胞质转入细胞核，并与Maf蛋白结合形成异质二聚体后与ARE结合，导致一系列基因的转录激活，调控Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶（HO-1、过氧化物酶-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶等）或药物转运体的转录活性［12-13］。HO-1能促进产生胆绿素、铁离子和一氧化碳，这些产物在保护细胞免受氧化损伤、调节细胞凋亡、细胞炎症以及促进血管生成等方面发挥重要作用［14］。有研究表明，许多疾病的发生、发展与Nrf2/HO-1通路抑制导致的氧化应激增强有关。例如在横纹肌溶解的急性肾损伤中，Nrf2基因敲除的小鼠活性氧显著增加，其肾功能和生存率明显降低［15］。因此Nrf2/HO-1是生物进化过程中对外界刺激形成防御的一种抗损伤机制，也是机体抗氧化应激的主要信号通路［16-17］。

在缺血再灌注状态下，体内的氧化物质大量堆积，而抗氧化物质大量丢失，导致膜脂质过氧化增强，蛋白质功能抑制，核酸及染色体破坏，进一步加重病情恶化［18］。许多研究表明活性氧作为体内强氧化物，可以氧化核酸、蛋白质、脂质及染色体等物质；同时导致线粒体膜通透性增加，阻断ATP合成，进一步介导细胞凋亡，促进缺血再灌注的发生、发展［19］。而SOD作为细胞内氧自由基清除剂可清除活性氧，在减轻IRI中发挥重要作用［20］。自由基可通过作用于脂质发生过氧化反应，生成丙二醛（MDA），可直接引起细胞毒性损伤，因此，组织MDA含量被认为是脂质过氧化的一个重要指标［21］。本实验结果显示，与Sham组相比，I/R组肾组织活性氧表达升高，SOD的活性受到抑制，MDA含量上升，伴血清Scr、BUN升高，肾脏病理、肾脏组织细胞凋亡增加，说明大鼠肾脏缺血再灌注损伤会导致氧化应激的产生。同时与Sham组相比，I/R组大鼠肾组织的Nrf2、HO-1表达增加，进一步说明Nrf2/HO-1通路可能参与肾脏缺血再灌注损伤过程。

此外本研究结果显示，与I/R组相比，大鼠造模前行Nrf2阻断剂ATRA预处理后，肾组织Nrf2、HO-1的表达显著减少，SOD活性严重下降，活性氧、MDA含量明显增加，伴肾功能、肾病理损伤加重，肾脏组织细胞凋亡亦明显增加。研究结果提示，ATRA通过抑制肾IRI中Nrf2和HO-1蛋白的表达，降低组织抗氧化损伤的作用，加重肾组织细胞的病理损伤及凋亡，进一步加重肾脏IRI，说明ATRA抑制Nrf2、HO-1表达会加重肾脏缺血再灌注损伤进程。

综上所述，Nrf2/HO-1通路参与肾脏缺血再灌注损伤过程，行ATRA预处理后会抑制大鼠肾脏Nrf2、HO-1表达，加重氧化应激，进一步加重肾脏IRI。研究结果提示，在肾脏缺血再灌注过程中激活Nrf2/HO-1信号通路，可以增强组织细胞的抗氧化能力，减轻肾脏IRI损伤，这为我们治疗或减轻肾脏IRI进程提供了理论依据。