磁共振动态增强结合血循环肿瘤细胞、循环游离DNA对乳腺癌的临床诊断研究

张倩，俱京涛，张雅琼，张春谦

作者单位：1沧州市人民医院核磁共振室，河北 沧州061000；2北京中医药大学房山医院，北京 102400；3石家庄市第三医院放射科，河北 石家庄050000；4沧州市中心医院CT室，河北 沧州061000

乳腺癌是临床常见恶性肿瘤类型之一，具有高发病率、病死率等特征［1］。目前有关乳腺癌发病机制尚未十分明确，且早期多无特异性临床表现，故常需与乳腺囊肿、炎症等良性疾病鉴别诊断。血循环肿瘤细胞（CTCs）主要来源于转移或原发肿瘤，能有效反映肿瘤侵袭与转移［2］。循环游离DNA（cfDNA）是循环血中游离在细胞外的高度片段化DNA，在肺癌、食管癌等多种疾病诊断中的价值现已被证实［3］。目前乳腺癌影像学研究逐渐深入到分子生物学层面，采用影像学联合细胞因子进行诊断已成为可能。磁共振动态增强（DCE-MRI）是MRI扫描序列之一，可观察病变血流动力学特征，同时其定量参数能反映造影剂在肿瘤内的动态分布情况，对提高疾病诊断准确性意义重大［4］。但目前有关DCE-MRI结合CTCs、cfDNA诊断乳腺癌的报道少见。鉴于此，本研究就DCE-MRI结合CTCs、cfDNA对乳腺癌的诊断价值进行了探讨，以期为临床治疗该病提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集沧州市人民医院2020年6月至2021年11月收治的乳腺癌病人的临床资料。纳入标准：（1）均经术后穿刺病理活检确诊为肿块型乳腺癌；（2）无MRI检查禁忌证；（3）影像学图像清晰，不影响诊断；（4）实验室、影像学及病理等资料完整。排除标准：（1）存在自身免疫疾病或全身感染性疾病；（2）孕妇、交流障碍、意识障碍等特殊人群；（3）进行化疗、放疗等治疗者；（4）循环功能严重障碍、肝肾功能严重损伤者；（5）非肿块型或直径较小无法进行病灶常规测量者。根据公式：N=Z²×σ²/d²，置信区间95%，抽样误差10%，标准差取值0.5，得到预计样本量96例，根据纳入及排除标准，最终82例乳腺癌病人纳入本次研究。将82例乳腺癌病人纳入乳腺癌组，病人均为女性，病人年龄范围为26～67岁，年龄（44.42±6.17）岁。临床分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期54例，58例伴淋巴结转移。

另选取同期符合纳入、排除标准的乳腺良性病变病人65例作为良性组。良性组纳入标准：（1）影像学图像资料完整；（2）未合并其他疾病；（3）经过病理学活检证实；排除标准：（1）未进行CTCs、cfDNA检测者；（2）既往行乳腺手术史者；（3）非妊娠期、哺乳期女性。乳腺良性病变病人作为良性组，病人年龄范围26～68岁，年龄（45.18±7.05）岁。两组资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 MRI检查 MRI平扫：3.0 T飞利浦磁共振扫描仪，乳腺联合线圈，行轴位快速自旋回波T1WI、T2WI及冠状自旋回波脂肪饱和T2WI序列扫描。②DWI扫描参数：重复时间（TR）9 145 ms，回波时间（TE）79 ms，层厚、间距分别为3.5 mm、0 mm。b值=0、800 s/mm2。③增强扫描：对比剂为Gd-DTPA 0.2 mmol/kg，注射速率2 mL/s，随后快速推注20 mL 0.9%氯化钠溶液，随后行动态增强扫描，注入对比剂同时立即开始eTHRIVE扫描，参数：TR 4.3 ms，TE 2.1 ms，层厚1.5 mm，矩阵280×339，FOV 280 mm×340 mm。共9期，每期74 s。扫描结束后利用相应MRI工作站进行图像处理，并选择病变最佳层面，将兴趣区（ROI）置于病变实质区域（ROI面积根据病变实质区域面积而定），避开钙化、血管、坏死组织，每例至少重复测量3次，取平均值，由同一技师进行上述操作。定量参数包括速度常数（Ktrans）值、速率常数（Kep）值及血管外细胞外容积分数（Ve）。

1.2.2 CTCs、cfDNA检测 空腹抽取两组病人晨起静脉血5 mL，离心（3 500 r/min，离心半径15 cm，5 min），分离上层血浆，低温保存用于cfDNA提取检测。采用qPCR检测外周血cfDNA，提取血浆中DNA，基于实验室前期建立的Alu序列RTFQ PCR检测cfDNA的方法进行检测：针对Alu115、247序列的引物：（5'-3'）Alu115正向CCTGAGGTCAGGAGTT CGAG，反向CCCGAGTAGCTGGGATTACA；Alu 247正向GTGGCTCACGCCTGTAATC，反向CAGGCTGGAGTGCAGTGG。按说明书进行配置成10 µmol/mL溶液，置于低温保存。PCR循环参数：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 S，60 ℃ 60 s，共35个循环。完成扩增后，对数据进行分析，并取3次结果均值作为1次检测结果。以长、短片段（115 bp、247 bp）扩增产物比值作为cfDNA完整性指标。

CTCs采用Cell Search系统检测，取7.5 mL血浆样本与6.5 mL缓冲液置于Autoprep锥形管中，离心10 min后，取上清液，置入Autoprep系统中检测。将每7.5毫升外周血中检出至少1个CTCs定义为CTCs表达阳性。

1.3 观察指标 比较两组DCE-MRI定量参数、CTCs、cfDNA水平，并对比MRI一般特征，包括边缘情况、形态、强化、TIC分型及早期增强率。分析上述因子与乳腺癌临床特征的关系及DCE-MRI结合CTCs、cfDNA诊断价值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析本组数据，各组DCE-MRI定量参数、CTCs、cfDNA水平均以描述，行t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；诊断价值采用ROC曲线分析，ACU值显著性检验采用Z检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组DCE-MRI定量参数及CTCs、cfDNA比较 乳腺癌组DCE-MRI定量参数Ktrans、Kep及Alu247/115水平明显高于良性组，CTCs计数多于良性组（P＜0.05）。见表1。

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病变65例磁共振动态增强（DCE-MRI）定量参数及CTCs、cfDNA比较/

表1 乳腺癌82例及乳腺良性病变65例磁共振动态增强（DCE-MRI）定量参数及CTCs、cfDNA比较/

注：cfDNA为循环游离DNA，CTCs为血循环肿瘤细胞，Ktrans为速度常数，Kep为速率常数，Ve为血管外细胞外容积分数。

组别良性组乳腺癌组t值P值Alu247/115 0.55±0.12 0.97±0.32 10.30＜0.001例数65 82 Ktrans/min 0.05±0.01 0.18±0.04 25.56＜0.001 Kep/min 0.51±0.11 1.32±0.27 22.73＜0.001 Ve 0.13±0.03 0.14±0.04 1.68 0.096 CTCs计数/（个/毫升）10.15±1.45 12.97±2.14 9.09＜0.001

2.2 两组MRI一般特征比较 良性组边缘多光滑，形状规则，内部强化以均匀为主，TIC分型Ⅰ型多见，早期增强率＜60%，乳腺癌组边缘毛刺征、形状不规则，内部不均匀强化为主，以TIC分型Ⅲ型多见，早期增强率＜60%占比高。见表2。

表2 乳腺癌82例及乳腺良性病变65例MRI一般特征比较/例（%）

2.3 CTCs、cfDNA与乳腺癌临床特征间的关系 淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期者CTCs数量、Alu247/115水平明显高于无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期者（P＜0.05），见表3。

表3 乳腺癌82例血循环肿瘤细胞（CTCs）、循环游离DNA（cfDNA）与乳腺癌临床特征间的关系/

表3 乳腺癌82例血循环肿瘤细胞（CTCs）、循环游离DNA（cfDNA）与乳腺癌临床特征间的关系/

特征CTCs计数/（个/毫升）Alu247/115年龄＜45岁≥45岁肿瘤长径＜5 cm≥5 cm病理类型浸润性导管癌导管原位癌浸润性小叶癌临床分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移是否例数4 2 t，P值1.56，0.124 t，P值0.67，0.503 40 12.61±1.87 13.34±2.36 0.95±0.21 0.99±0.32 1.16，0.251 1.18，0.242 69 13 12.85±2.06 13.61±2.74 0.98±0.19 0.91±0.23 2.26，0.111 0.01，0.998 54 21 7 12.63±1.85 13.74±2.36 13.21±2.59 0.97±0.33 0.96±0.31 0.98±0.36 7.11，＜0.001 5.31，＜0.001 28 54 9.76±1.03 14.63±3.54 0.68±0.17 1.12±0.42 17.79，＜0.001 9.33，＜0.001 58 24 15.56±3.57 6.71±0.63 1.17±0.52 0.48±0.12

2.4 DCE-MRI结合CTCs、cfDNA对乳腺癌诊断价值分析 三者联合（DCE-MRI+CTCs+cfDNA）诊断效果优于单一检测CTCs、cfDNA检测（P＜0.05），见表4。

表4 DCE-MRI结合CTCs、cfDNA对乳腺癌诊断价值分析

2.5 病例分析 女，45岁，乳腺癌（图1），MRI扫描示双侧乳腺对称，腺体呈散在纤维腺体型，背景实质强化轻微，右侧乳腺外上象限约10点方向可见一不规则结节状长T1稍长T2信号灶（图1A），DWI呈高信号（图1B）。MRI增强扫描可见病灶呈明显不均质强化（图1C～1E）。大小约为16 mm（上下径）×13 mm（前后径）×12 mm（左右径），边缘欠清晰，可见浅分叶，邻近皮肤未见明显增厚，右侧乳头未见凹陷。病理诊断为乳腺浸润性导管癌（图1F）。

图1 女，45岁，乳腺浸润性导管癌，乳房MRI扫描图像及病理图片：A为乳房T1WI图；B为乳房T2WI图；C为乳房增强1期图；D为乳房增强2期图；E为乳房增强3期图，F为乳腺切除标本病理学图（HE染色×10）

3 讨论

随着疾病的进展，原发性乳腺癌易发生淋巴结转移和血行转移。早期诊断和治疗是改善病人预后的关键［5］。病理活检仍是乳腺癌临床诊断的金标准，但属于有创检查，在早期筛查中存在一定局限性［6］。目前，临床早期筛查主要依靠影像学检查和血清肿瘤标志物。影像学检查中，MRI检查具有多角度成像、分辨率高等优势，有助于发现细小病灶或多发病灶，近年来检查适应证范围逐渐扩大［7］。本研究发现，良性组、乳腺癌组边缘、形状、内部强化、TIC分型及早期强化率等MRI一般特征均具有差异，与既往报道结果相似，病灶边缘出现毛刺，提示肿块浸润性生长、容易浸润周围血管、淋巴管，淋巴结更易发生转移。由此可见，多数乳腺病灶的常规MRI形态学有一定特征可循，通过分析MRI影像学表现能对病灶行初步定性评估。值得注意的是，部分极低度恶性或体积较小的病变处，影像学征象存在一定重叠，常规MRI检查在该类病灶的定性评估效果欠佳［8］。

DCE-MRI属于一种功能性MRI成像方法，可通过绘制TIC来评估肿瘤动态强化特征，既往研究指出，血管生长在肿瘤发生、发展中具有重要作用，而DCE-MRI可观察血流动力学情况，通过收集定量参数用于评估肿瘤血管生成状态［9］。在DCE-MRI定量参数中，Ktrans是指对比剂由血浆向血管外细胞外间隙（extracellular space，EES）转移的速率，与渗透性存在一定关系，可反映对比剂经血管腔内扩散至腔外的血流信息，实际上，Ktrans并非反映对比剂血管分布的理想参数，任何影响血流灌注的因素，譬如高血压、心输出量等均引起Ktrans值发生波动；Kep反应了对比剂由EES重新回流至血浆的速率，可提供血管外细胞间隙回流至腔内的相关信息，凸显肿瘤血管的生成特征；Ve则是指对比剂漏出的间隙或分布间隙［10］。

Bertani等［11］发现，乳腺良、恶性疾病DCE-MRI定量参数Ve比较差异无统计学意义，Ktrans、Kep比较差异有统计学意义。本研究结果与上述报道相符。究其原因可能是：乳腺癌病人肿瘤组织血管密度较高，血管外肿瘤细胞间隙增宽，微循环血容量大、流速快；而良性病灶相较乳腺癌组织，微血管较少，血管壁结构完整，血流灌注低，强化程度轻。本研究进一步通过ROC曲线分析发现DCE-MRI定量参数用于鉴别诊断乳腺良恶性疾病的AUC值达0.80，与王睿等［12］研究结果相似，证实DCE-MRI定量参数在良恶性乳腺疾病鉴别诊断中具有重要价值。值得注意的是良性组与乳腺癌组的DCE-MRI定量参数Ve比较无差异，推测其原因可能是Ve值在病变过程中变化较小，良、恶性肿瘤的Ve水平差异无统计学意义，因此引起良恶性肿块Ve值的变化范围产生重叠区域，进行统计学处理后未见两者间存在明显差异。另一方面亦可能与恶性变四周组织的水肿程度或动脉有关，实际上部分学者认为，可以通过延长获取图像的时间，解决上述技术问题，提高Ve值变化度，进而获取更高的诊断效果，但有关这一项解决方案目前尚存在争议，同时本研究中结果发现三者联合诊断效果与DCE-MRI相当，虽与以往文献资料显示联合效能优于单一影像学诊断的结果存在一定差异，引起这一差异的原因有待后续进一步深入探讨，但DCE-MRI暂时获得的诊断效果值得肯定。

近年来研究显示，肿瘤细胞生物学行为和其组织病理学改变与分子生物学之间存在某种关系［13-14］。CTCs属于异质肿瘤细胞，是原发、复发或转移病灶脱落后，从脉管系统浸润外周血循环的肿瘤细胞总称，通过检测血液中CTCs数量可获取肿瘤实时信息［15］。cfDNA可来源于坏死、凋亡的肿瘤细胞或由肿瘤细胞自身分泌［16-17］。已有研究证实，cfDNA完整性在肿瘤诊断、评估分期等具有重要作用［18］。本研究中，乳腺癌组CTCs数量、基于Alu序列的cfDNA247/115比值均高于良性组；且随分期增高、淋巴结转移，CTCs数量、Alu247/115水平亦更高，表明CTCs、cfDNA完整性可能成为早期诊断乳腺癌、评估其病情的可靠指标。通过ROC曲线分析乳腺癌CTCs、cfDNA完整性水平单项检测时，发现二者单独检测灵敏度、特异度较低，但联合DCE-MRI检查时灵敏度、特异度分别达0.93、0.84，可见DCE-MRI结合CTCs、cfDNA能帮助临床获取更高的诊断效果，推测其原因可能是联合检查可为临床提供影像学、分子生物学方面的双重信息，使诊断依据更加充分，从而提高诊断价值［19-20］。

综上所述，乳腺癌病人CTCs、cfDNA存在异常表达，可能与病人临床分期、淋巴结转移有关，相对单一实验室检测，DCE-MRI结合CTCs、cfDNA检测能获取更多可靠信息。本研究的不足之处在于属于回顾性研究，样本量偏低可能对统计学结果产生一定偏倚，后续仍需扩大样本量，进一步行多中心前瞻性研究证实结论。