膀胱癌组织微RNA-212、微RNA-137、微RNA-200表达与临床病理特征的相关性及预测经尿道膀胱肿瘤切除术后复发的效能研究

张家兴，张际青，杨云波，唐伟，刘海超，刘桂迁，李卫旗，裴志圣

作者单位：河北燕达医院泌尿外科，河北 廊坊065201

膀胱癌是十大常见恶性肿瘤之一，其预后与肿瘤浸润程度、治疗情况有关。对非肌层浸润性膀胱癌给予经尿道膀胱肿瘤切除术（TURBT）+膀胱灌注治疗，对肌层浸润性膀胱癌常给予根治性膀胱全切术，准确评估病理特征，明确膀胱癌浸润程度对临床选取合适治疗方式具有重要意义［1］。且无论是非肌层浸润性还是肌层浸润性膀胱癌，治疗后复发均是不良预后的独立相关危险因素，因此研究复发相关标志物是必要的［2］。根据既往报道［3］，上皮-间质转化是膀胱癌细胞发生肌层浸润、增殖复发的关键环节。微RNA-212（miRNA-212）、微RNA-137（miRNA-137）、微RNA-200（miRNA-200）均是非编码单链RNA分子，其中敲低miRNA-212可促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭与上皮-间质转化，上调miRNA-137、miRNA-200表达可促进直肠癌细胞侵袭与上皮-间质转化，因此推测三者可能与膀胱癌临床病理特征、增殖复发有关［4-6］。基于此本研究探讨膀胱癌组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达与临床病理特征的相关性及预测TURBT后复发的效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用SPSS 24.0确定样本量与处理数据，n=［（Z1-α/2）2P（1-P）］/δ2，当α=0.05时，Z1-α/2=1.96，P=0.36，δ=0.098，计算出所需最小样本量n=92，为避免脱落、失访等影响样本量，n取100。选取2017年6月至2021年6月河北燕达医院100例膀胱癌病人作为研究对象。其中女52例，男48例；年龄范围44～80岁，年龄（64.88±7.25）岁；组织学类型均为膀胱尿路上皮癌。所有病人术前均详细询问病史、症状、体征，完成体格检查、辅助检查（血常规、肝肾及其他必要的实验室生化检查、尿细胞学和肿瘤标志物、超声、CT、MRI等必要的影像学检查），其中92例术前完成病理活检，8例行诊断性TURBT并完成肿瘤的病理诊断和分级、分期，同时切除肿瘤；结合术前、术中、术后相关检查，参考美国癌症联合委员会（AJCC）第8版本TNM系统T分期：Ta期39例，T1期37例，T2期10例，T3期8例，T4期6例；无淋巴结转移67例，有淋巴结转移33例；无远处转移70例，有远处转移30例，世界卫生组织2004组织学分级标准：低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤28例，低级别乳头状尿路上皮癌32例，高级别乳头状尿路上皮癌40例；肌层浸润性膀胱癌28例，非肌层浸润性膀胱癌72例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人签署知情同意书。

（1）纳入标准：符合膀胱癌诊断标准［7］；年龄＞18岁；能够配合随访；需明确肿瘤的病理诊断和分级、分期，同时切除肿瘤；非肌层浸润性膀胱癌；肌层浸润性膀胱癌病人保留膀胱综合治疗的外科治疗手段。（2）排除标准：凝血功能明显异常或全身出血性疾病；精神障碍，不能配合手术者；严重泌尿生殖系统感染者；髋关节强直、脊柱畸形等，不能采取截石位；严重的心脏血管疾病者；尿道狭窄未治或闭锁，不能置入电切镜；合并肺癌、肝癌等其他原发肿瘤者；免疫功能缺失者；严重的肺部疾病，不能耐受手术；严重心律失常、急性心肌梗死；严重糖尿病，血糖未能有效控制；近期发生脑血管意外。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法与随访 所有病人术前均完善影像学、病理等检查，对符合相关指征病人给予TURBT，切除深度至膀胱壁的肌层，切除范围包括肿瘤根部和基底层，烧灼瘤体基底周围2 cm的正常尿路上皮黏膜，手术切除标本送病理切片检查，并取癌变组织旁2 cm的组织作为癌旁组织备测。行TURBT病人中，8例行诊断性TURBT明确肿瘤的病理诊断和分级、分期，同时切除肿瘤，结合围手术期相关检查最终明确为非肌层浸润性尿路上皮癌；64例完成术前病理活检，行TURBT切除肿瘤，最终明确为非肌层浸润性膀胱癌，组织学分型为膀胱尿路上皮癌；28例完成术前病理活检，行TURBT作为保留膀胱综合治疗的外科治疗手段，最终明确为肌层浸润性膀胱癌，组织学分型为膀胱尿路上皮癌。依据专家共识［8］，接受TURBT所有病人给予术后即刻膀胱灌注化疗（术后规律行膀胱灌注化疗），均按照以上专家共识规范完成治疗。以门诊方式随访1年，非肌层浸润性膀胱癌随访中使用膀胱镜检查，一旦发现异常行活检及病理检查；肌层浸润性膀胱癌随访内容包括体格检查、血液生化检查、胸部X线和B超（肝肾、腹膜后）、膀胱镜检查，统计病人复发率，并根据是否复发分为复发组、未复发组。

1.2.2 miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200检测主要试剂、仪器：SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物科技）；miRNA提取试剂盒（日报Toyobo公司）；Taq DNA聚合酶（简称Taq酶，美国Thermo Fisher公司）；ReverTra Ace荧光定量PCR试剂盒（上海擎科生物）；脱氧核苷三磷酸（dNTP，美国Thermo Fisher公司）；PCR仪器（7500型，美国ABI公司）。

检测方法：取癌组织和癌旁组织标本，采用实时荧光聚合酶链反应法检测miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达，Trizol试剂盒提取RNA，加入1 mL Trizol试剂，用匀浆器研磨成浆，裂解10 min，加入200 µL氯仿，混匀，4 ℃，12 000×g，10 cm半径离心15 min，可见分成上（RNA）中（蛋白）下（DNA）三相。紫外分光光度法检测260 nm和280 nm处的吸光度（absorbance，A）值，计算A260nm/A280nm比值，即RNA浓度为1.8～2.3符合要求。配置反转录体系：取RNA标本1 µL、逆转录酶0.5 µL、通用反转录引物1 µL、缓冲液2 µL，补充重蒸水至10 µL，通用茎环引物序列5'-GAAAGAAGGCGAGGAGCAGATCGAGGAAGAAGACGGAAGAATGTGCGTCTCGCCT TCTTTCNNNNNNNN-3'，反转录反应参数：5 ℃ 5 min，10 ℃ 10 min，15 ℃ 25 min，37 ℃ 30 min，98 ℃ 5 min，合成互补DNA（cDNA）后进行PCR扩增。配置PCR扩增反应体系：cDNA 1 µL、SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR液5 µL、引物2 µL、加入双蒸水2 µL，总反应体系为20 µL，扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达量以相对内参U6来表示。

1.3 观察指标 （1）比较不同组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达。（2）比较不同病理特征病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达。（3）比较复发与未复发组临床资料、miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达。（4）分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200预测复发的价值。（5）分析不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达水平病人复发的危险度。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 24.0分析，计数资料用例（%）表示，以χ2检验，等级资料采用非参数秩和检验；符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较以单因素方差分析，两两比较以LSD-t检验，两组间比较以独立样本t检验；采用受试者操作特征（ROC）曲线分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200预测复发的价值，使用ROC曲线下面积（AUC）评价预测可靠性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达 癌组织miRNA-212低于癌旁组织，miRNA-137、miRNA-200表达高于癌旁组织。见表1。

表1 膀胱癌100例不同组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达/

表1 膀胱癌100例不同组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达/

注：miRNA为微RNA。

组别癌组织癌旁组织t值P值miRNA-200 24.56±7.39 7.33±2.21 22.34＜0.001例数100 100 miRNA-212 2.03±0.56 4.52±1.18 19.06＜0.001 miRNA-137 2.69±0.45 1.28±0.30 26.07＜0.001

2.2 不同病理特征病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达 不同组织学分级、T分期、N分期、M分期病人miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着组织学分级、TNM分期递增，miRNA-212表达逐渐降低，miRNA-137、miRNA-200表达逐渐升高（P＜0.05）；肌层浸润性膀胱癌病人miRNA-212低于非肌层浸润性膀胱癌，miRNA-137、miRNA-200高于非肌层浸润性膀胱癌（P＜0.05）。见表2。

表2 膀胱癌100例不同病理特征时miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达比较/

表2 膀胱癌100例不同病理特征时miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达比较/

注：miRNA为微RNA。

病理特征WHO2004组织学分级低度低级别高级别T分期Ta T1 T2 T3 T4 N分期N0 N1～N3 M分期M0 M1病理分型非肌层浸润性肌层浸润性例数miRNA-212t（F）值（78.41）P值＜0.001 miRNA-137t（F）值（53.07）P值＜0.001 miRNA-200t（F）值（124.48）P值＜0.001 28 32 40 1.28±0.36 1.74±0.41 2.79±0.66 3.85±1.07 2.77±0.84 1.81±0.51 38.06±7.23 22.13±5.19 17.05±4.22（38.72）＜0.001（197.98）＜0.001（143.79）＜0.001 39 37 10 8 6 6 7 4.11±0.73 3.60±0.62 3.02±0.65 2.11±0.58 1.12±0.34 1.80±0.33 2.56±0.39 3.89±0.46 4.94±0.67 6.22±0.95 10.26±2.22 16.59±2.84 21.01±3.56 29.44±4.79 38.52±6.80 20.80＜0.00120.80＜0.00115.12＜0.001 33 2.61±0.46 0.85±0.22 2.11±0.37 3.87±0.45 18.54±5.04 36.78±6.79 20.15＜0.00136.04＜0.00122.36＜0.001 70 30 2.48±0.37 0.98±0.26 1.86±0.33 4.63±0.40 17.22±4.18 41.69±6.59 13.18＜0.0019.48＜0.00117.16＜0.001 72 28 2.50±0.66 0.82±0.21 2.23±0.70 3.87±0.95 17.31±6.02 43.20±8.44

2.3 复发与未复发组临床资料、miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达 TURBT术后随访1年，无失访病例，36例复发，64例未复发。复发组miRNA-212低于未复发组，miRNA-137、miRNA-200高于未复发组（P＜0.05）。见表3。

2.4 miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200预测复发的价值 绘制miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200预测复发的ROC曲线显示，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200的AUC分别为0.82、0.79、0.80，三者联合预测复发的AUC为0.93，见表4。

2.5 不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达水平病人复发率 miRNA-212高水平病人复发率低于低水平病人，miRNA-137、miRNA-200高水平病人复发率高于低水平病人（P＜0.05），见表5。

表5 膀胱癌 100例中不同miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达水平病人复发率/例（%）

3 讨论

miRNA-212位于染色体17p13.3，在多种肿瘤组织中表达异常，并能调控肿瘤发生及进展过程，但在膀胱癌中的研究较少［9］。本研究结果显示，膀胱癌组织miRNA-212低于癌旁组织，随着组织学分级、TNM分期递增，miRNA-212表达逐渐降低，与膀胱癌及其病理特征有关，扮演了抑癌基因角色。Zhang等［10］报道，在肺癌细胞中，miRNA-212表达降低，采用相关措施靶向miRNA-212，沉默miRNA-212表达，可促进肺癌细胞侵袭与迁移。Peng等［11］报道，前列腺癌中miRNA-212表达降低，转染miRNA-212模拟物，可显著抑制癌细胞恶性生物学行为，均提示miRNA-212具有抑癌基因作用，本研究观点与之相似。miRNA-212除调控上皮-间质转化途径外，还能通过泛素结合酶E2T、磷酸化蛋白激酶AKT3等途径参与膀胱癌发病、进展［12］。复发组miRNA-212低于未复发组，提示miRNA-212还与术后复发情况有关。miRNA-212预测复发的AUC为0.82，呈现出一定预测价值，能为临床早期调整治疗方案、随访管理等提供参考。但Mou等［13］报道敲低miRNA-212可抑制结直肠癌细胞中的迁移、侵袭和上皮-间质转化，提示miRNA-212是一种促癌基因，本研究观点与之不符，其可能的原因有：（1）所研究的恶性肿瘤种类不同导致的，说明miRNA-212在不同恶性肿瘤中可能具有不同的调控机制，起到不同的调控作用；（2）本研究检测标本为人体的癌组织标本，与Mou等［13］报道系体外细胞实验相比，调控机制更复杂。鉴于miRNA-212在肿瘤领域尚存在争议，下一步仍需完善质控，进一步检测分析。

miRNA-137位于染色体1p22，在不同物种中其成熟序列的相似性几乎为100%，揭示了在不同物种中miRNA-137可能执行类似的生物学功能［14］。本研究发现，膀胱癌组织中miRNA-137表达高于癌旁组织，与张栋邦等［15］报道一致，提示miRNA-137与膀胱癌有关。在此研究基础上本研究还发现，分化程度越低，TNM分期越高，miRNA-137表达越高，对膀胱癌恶性生物学特征起到正向调控作用，是一种促癌因子，有助于评估病人病理特征，从而为诊断、治疗提供参考信息。根据Li等［16］报道，miRNA-137是通过促进基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达以及作用于下游磷酸化蛋白激酶AKT2途径，影响癌细胞增殖、侵袭、迁移的，但是否还有其他机制仍需后续的进一步探讨。同时本研究发现，与未复发病人相比，复发病人miRNA-137表达升高，预测复发的AUC为0.79，可作为预测膀胱癌TURBT后复发的一个标志物。

本研究发现，膀胱癌组织miRNA-200表达高于癌旁组织，随着组织学分级、TNM分期递增，miRNA-200表达逐渐升高，与膀胱癌及其病理特征有关。一方面miRNA-200能促进上皮-间质转化，使细胞连接与极性丧失，另一方面miRNA-200能促进癌症细胞的干性，诱导新生血管生成与肿瘤细胞转移，从而影响膀胱癌发生与进展［17］。复发病人miRNA-200高于未复发病人，与复发有关。miRNA-200高水平病人复发率高于低水平病人，提示miRNA-200高水平病人不仅恶性生物学行为较高，且术后更易发生转移，因此对miRNA-200高水平病人，应加强术后辅助治疗，增加随访频率，以便早期预防、发现复发，促进预后的改善。另本研究发现，miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200联合检测预测复发的AUC为0.93，明显高于任一单一指标，可见三者联合应用对复发的预测价值更高，因此建议临床联合应用，以提高预测准确性，为临床提供可靠的参考信息。本研究不足之处在于，纳入的T3、T4分期病人数量较少，在统计分析miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200与病理特征关系时，可能会造成数据的偏倚，下一步仍需增加病人数量进行进一步的验证分析。

综上，膀胱癌组织miRNA-212、miRNA-137、miRNA-200表达与临床病理特征相关，联合检测对TURBT后复发具有良好的预测能力，可作为预测术后复发的一种方案。