胃复春对胃黏膜肠化生患者胃黏膜菌群的影响❋

沈 睿,肖 灵,华召来,陆 斌,李美凤,周 平,张军峰△

(1. 南京中医药大学医学院,南京 210023;2. 扬中市肿瘤研究所,江苏扬中 212299;3. 扬中市人民医院,江苏扬中 212299)

胃复春由红参、香茶菜、炒枳壳组成,具有健脾益气、活血解毒、扶正祛邪、攻补兼施之功效,临床适用于胃癌前病变、胃癌手术后辅助治疗、慢性胃炎脾胃虚弱证等[1]。胃黏膜肠化生(gastric intestinal metaplasia, GIM)是典型的胃癌前病变,也是胃癌的独立风险因子[2]。慢性萎缩性胃炎伴GIM病因病机复杂,严重危害患者身心健康,目前尚无治疗共识。临床实践显示,益气活血、健脾活血、理气活血、温阳活血等活血化瘀大法辨治胃癌前病变,能够显著缓解临床症状,降低胃癌的发病率[3]。因此,具有益气活血功效的胃复春已经成为临床消化内科最常用中成药之一[4]。现代研究显示,胃复春可以促进胃黏膜修复再生,改善局部胃黏膜血液循环,增强机体免疫功能,抑制幽门螺杆菌,改善胃黏膜萎缩,降低胃黏膜癌变异型增生/肠化生等级[5]。最近研究发现,胃复春治疗胃癌前病变患者(包括GIM),能够显著改善患者症状、降低胃黏膜GIM病理等级,同时改善舌苔菌群,特别是胃复春治疗增强了两个舌苔菌群预测功能(胆汁酸分泌和叶酸合成)[6],促进胆汁分泌和增强脂质代谢可能体现了胃复春活血化瘀功效。

在生理状态下,胃液菌群密度为102～104CFU/mL,胃内菌群平衡,可抵御病原菌入侵,大量高通量菌群测序研究发现胃内菌群失调与胃炎、胃溃疡以及胃癌前病变相关[7]。在Correa级联(正常胃黏膜-慢性胃炎-癌前病变-胃癌)过程中,胃内菌群多样性逐渐降低,特别是晚期胃癌阶段,胃内酸性条件被破坏,导致口腔和肠道菌群在胃癌组织富集[8];慢性萎缩性胃炎患者胃菌群丰度和多样性显著高于胃癌患者[9];胃上皮内瘤变患者胃菌群多样性显著低于GIM患者。这些结果提示,胃菌群参与胃癌前病变的发生发展,调节胃内菌群可能是防治胃癌前病变的关键策略。因此,本研究观察了胃复春治疗对GIM患者胃菌群的影响,为探索胃复春防治胃癌前病变的功效机制提供新思路。本研究经扬中市人民医院临床伦理委员会批准:编号PHYC201605。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究遵循《赫尔辛基宣言》《涉及人的生物医学研究伦理准则》等有关规定,临床招募2018年11月—2019年6月在杨州市人民医院经胃镜病理确诊的GIM患者37例为胃复春治疗组,选择同期医院体检无异常的健康者31例作为对照组。

1.2 诊断标准

参照《中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见(2014年4月·长沙)》[10]诊断GIM,方法简述:空腹禁食8 h以上,进行胃镜检查,根据共识意见[11]进行胃镜检查和取样。胃镜检查取样包括贲门、胃体小弯、胃体大弯、胃窦小弯、胃窦大弯、幽门等5个部位,胃黏膜样本大小1～2 mm,取双份样本。胃黏膜样本用10%甲醛固定后,按照取样位置进行摆放并石蜡包埋,常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色进行病理分析,参考典型的胃黏膜肠化生判别重度、中度和轻度,见图1。取样任一部位出现肠化生则取相应的另一份样本。5个部位均无肠化生者作为对照组,取胃窦黏膜,进行菌群测序。

注:正常胃黏膜表现为黏膜上皮和腺体排列整齐规则。胃黏膜肠化生表现为黏膜炎症、腺体萎缩,可分为轻、中、重度肠化生,轻度表现为肠化区占腺体和表面上皮总面积的1/3以下,中度表现为肠化区占腺体和表面上皮总面积的1/3到2/3,重度表现为肠化区占腺体和表面上皮总面积2/3以上。

1.3 纳入标准

对照组纳入标准:无消化道不适症状,如胃痛、胃胀、腹痛、腹胀等。胃复春治疗组纳入标准:符合GIM病理诊断标准;年龄18～70岁之间;无消化道不适症状,如胃痛、胃胀、腹痛、腹胀等;患者对本研究知情,自愿参加并签署知情同意书。

1.4 排除标准

近1个月内使用过质子泵抑制剂、非甾体抗炎药、益生菌、抗生素等;肿瘤病史或心、肝、肾、肺严重器质性病变者;食管或胃黏膜手术史者;女性受试者处于妊娠或哺乳期;对本研究用药过敏者。

1.5 药物干预

每次发放2周的胃复春片(杭州胡庆余堂药业有限公司,40片/盒,国药准字Z20040003,批号为1806648),嘱患者按时服药,1日3次,1次4片。每周回访1次,治疗4周。停药1周后,行无痛胃镜病理复查。服药期间避免烟酒和辛辣饮食。

1.6 胃黏膜菌群检测与分析

胃黏膜菌群检测委托上海凌恩生物科技有限公司,方法简述如下:提取胃黏膜总DNA,用16S rRNA通用引物338F-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG,806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT进行PCR扩增,利用扩增产物建立Miseq PE文库用于高通量测序,QIIME(version 1.17)优化测序数据,按照97%相似性,用UPARSE35(version 7.1)软件实现可操作单元(operational taxonomic unit,OUT)聚类分析,利用Visual Genomics软件(Release 1,上海盈飞生物)进行Alpha多样性、群落结构和线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)或LEfSe(LDA EFfect Size)分析等,利用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)进行菌群的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes,KEGG)功能分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,R软件(Version 3.4.2)的pheatmap、ggplot2实现图形可视化,GraphPad Prism(Version 8.0.1)绘制箱形图和小提琴图,所有统计检验为双尾,P<0.05表示显著统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

研究人群包括31例对照组和37例GIM患者,其中,对照组和GIM组年龄分别为(62.1±3.4)和(62.2±3.5)岁,性别分布(男/女)分别为14/17和17/20,体质量指数(body mass index,BMI)分别为(24.2±2.4)和(24.4±3.2),差异均无显著统计学意义(P>0.05)。37例GIM患者肠化等级表现为轻度24例、中度11例、重度2例;胃复春治疗后,胃镜病理报告显示,23例患者肠化生未检出,5例患者GIM等级下降,肠化生等级改善有效率75.7%。GIM患者经胃复春治疗前后,快速尿素酶试验阳性率分别为29.7%(11/37)和37.8%(14/37),差异无统计学意义(P>0.05);治疗前后,GIM患者血清胃蛋白酶原比率(PG I/ Ⅱ)分别为(3.16±0.95)和(4.10±1.12),差异具有显著统计学意义(P<0.05);治疗前后,GIM患者胃黏膜炎症活动比例分别为56.8%(21/37)和32.4%(12/37),差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。这些结果提示胃复春对幽门螺杆菌感染无显著影响,但可以改善胃黏膜萎缩程度和黏膜炎症活动。

2.2 胃复春对GIM患者胃黏膜菌群多样性的影响

本研究每份胃黏膜平均检测到(34 430±12 474)条有效序列,评估胃复春对胃黏膜菌群多样性的影响,4个alpha多样性指数中,Ace、Chao和Observed OTUs表示菌群丰富度,Shannon表示菌群多样性。采用非参数曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyUTest)分析对照组、GIM患者治疗前与治疗后的多样性指数,结果显示,GIM患者胃黏膜菌群丰富度指数Ace和Chao均显著高于对照组(P<0.01),胃复春治疗后胃黏膜菌群3个丰富度指数均显著高于治疗前(P<0.001);然而,菌群多样性Shannon指数无显著变化(P>0.05),见图2。因此,胃复春治疗增加了GIM患者胃黏膜菌群的丰富度,但对菌群多样性无显著影响。

注:绿色点表示对照组(Control),红色点和蓝色点表示GIM患者,红色表示胃复春治疗前,蓝色表示胃复春治疗后;**P<0.01,***P<0.001;胃黏膜肠化生(GIM)

2.3 胃复春对GIM患者胃黏膜菌群结构的影响

本研究所有胃黏膜样本共检测到1 106个OTUs,归属于30门、63纲、144目、253科和616属。菌群的群落结构和beta多样性分析显示,胃复春治疗GIM患者后,胃黏膜菌群发生了显著变化,见图3。在门水平,胃黏膜菌群结构显示,优势菌门(相对丰度>1%)由高到低依次为变形菌门(Proteobacteria)、ε-菌门(Epsilonbacteraeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和梭杆菌门(Fusobacteria),见图3a。在属水平,对照组胃黏膜优势菌主要为雷尔氏菌属(Ralstonia)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、Labrys、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、Pseudolabrys、Hydrobacter、贪噬菌属(Variovorax);胃复春治疗后,除螺杆菌属(Helicobacter)外,GIM患者胃黏膜优势菌属发生显著变化,治疗前的GIM患者胃黏膜优势菌属与对照组类似,包括假诺卡氏菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属等,治疗后的GIM患者胃黏膜优势菌属包括链球菌属(Streptococcus)、普雷沃菌7(Prevotella7)、奈瑟菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、盐单胞菌属(Halomonas),见图3b。主坐标分析(Principal coordinate analysis,PCoA)进一步证实,胃复春治疗后显著改变了GIM患者胃菌群状态,见图3c。

A.为胃黏膜菌群优势菌门结构图;b.胃黏膜菌群前30位相对丰度热图;c.胃复春治疗GIM胃黏膜菌群主坐标分析(PCoA)

在门水平,与对照组相比,GIM患者胃Epsilonbacteraeota和Fusobacteria丰度显著升高,Proteobacteria丰度显著下降;与治疗前的GIM组相比,胃复春治疗组(GIM+Weifuchun),Epsilonbacteraeota、Bacteroidetes、Firmicutes和Fusobacteria丰度显著升高,Proteobacteria丰度显著降低(P<0.05),见图4。

注:与对照组(Control)比较**P<0.01,***P<0.001;与GIM组比较##P<0.01,###P<0.001

2.4 胃复春治疗GIM患者相关胃黏膜标志菌群分析

LEfSe分析或LDA分析是一种用于发现和解释高维度数据生物标识(基因、通路和分类单元等)的分析工具,可以进行2个或多个分组的比较,强调统计意义和生物相关性,能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标识。以对照组和治疗前GIM患者进行LEfSe分析,结果显示,螺杆菌属、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃菌属1(Prevotella1)、罗氏菌属(Rosia)等27个细菌分类单元富集在GIM组,放线菌属(Actinomyces)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)等11个细菌分类单元富集在对照组,见图5。在治疗前的37例GIM患者中,LDA分析显示,轻度GIM未见标志菌群,嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae)、陶厄氏菌属(Thauera)、副拟杆菌(Parabacteroides)等9个分类单元富集在中度GIM组;黄杆菌属(Flavobacterium)、微单孢菌科(Micromonosporaceae)和微单孢菌目(Micromonosporales)富集在重度GIM组,见图6,提示胃黏膜菌群与GIM严重程度相关。

注:对胃复春治疗前的GIM组(GIM patients)与对照组(Control)进行线性判别(LEfSe)分析,展示差异细菌分类单元,红色表示在GIM组显著升高的菌群,绿色表示在对照组显著升高菌群;图中节点表示细菌分类单元,自内向外每圈的节点表示不同的门、纲、目、科、属

注:按照肠化生轻、中、重程度治疗前GIM患者分组,进行胃黏膜菌群线性判别(LDA)分析,红色表示中度肠化生组(Moderate GIM)显著升高的细菌分类单元,绿色表示重度肠化生组(Severe GIM)显著升高的细菌分类单元;g_表示属(genus),f_表示科(family),o_表示目(order),c_表示纲(class)

最后,采用LDA分析胃复春治疗相关胃黏膜标志菌群,16个菌属富集在胃复春治疗组,见图7,其中,5个优势菌属(相对丰度>1%)分别为不动杆菌属(Acinetobacter)、罗氏菌属(Rothia)、放线菌属(Actinomyces)、梭杆菌属(Fusobacterium)和纤毛均属(Leptotrichia),其他菌属包括奇异菌属(Atopobium)、鞘脂菌属(Sphingobium)、Sediminibacterium、月形单胞菌属3(Selenomonas3)、假节杆菌属(Pseudarthrobacter)和柄杆菌属(Caulobacter)等,这些菌属在胃复春治疗的GIM患者胃内丰度均显著上升(P<0.05),可能是胃复春治疗GIM的潜在靶点或标志菌群。

注:在属水平采用线性判别(LDA)分析,蓝色表示在对照组(Control)胃黏膜丰度显著升高的菌属,红色表示胃复春治疗前GIM组(GIM)胃黏膜中丰度显著升高的菌属,绿色表示胃复春治疗后GIM组(GIM+Weifuchun)胃黏膜中丰度显著升高的菌属;LDA评分越高,表示差异越显著

2.5 胃复春治疗GIM相关胃黏膜菌群预测功能方法

利用PICRUSt推断菌群功能谱,通过LDA分析胃复春治疗GIM的胃菌群KEGG预测功能,发现7个菌群预测功能与胃复春治疗相关,见图8,为ABC转运蛋白(ABC transporters)、膜转运(Membrane Transport)、脂类代谢(Lipid Metabolism)、脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism)等。

注:基于胃黏膜菌群KEGG预测功能进行线性判别(LDA)分析,灰色表示在对照组(Control)显著增强的预测功能,红色表示胃复春治疗前(GIM)显著增强的预测功能,绿色表示胃复春治疗后(GIM+Weifuchun)显著增强的预测功能;LDA评分越高,表示差异越显著

3 讨论

胃复春治疗萎缩性胃炎癌前病变临床应用专家共识认为,胃复春适用于萎缩性胃炎癌前病变,病理诊断为萎缩性胃炎伴肠化生和/或低级别上皮内瘤变者尤为适宜,对胃虚弱证、胃络瘀血证患者更具优势[12]。荟萃分析显示,胃复春治疗CAG的主要机制包括促进幽门螺杆菌转阴、改善胃黏膜萎缩病变、促进胃黏膜修复、维持胃微生物生态系统平衡[13]。王桂彬等针对胃癌辨治提出“求衡复运”理论,核心要义在于“求衡于五脏,复运于脾胃”,体现了“无致邪,无伐正”的中和思想[14]。因此,恢复胃部菌群平衡是防治胃癌的关键机制。本研究发现,胃复春治疗可显著改善GIM患者肠化生等级、重塑胃黏膜微生态系统。本研究中,所有人群的胃黏膜优势菌门结构与前期研究类似[15],胃复春治疗后,GIM患者胃黏膜常见的罗氏菌属丰度显著升高,前期研究发现胃癌组织的罗氏菌属丰度显著低于胃癌旁组织[16],提示胃复春治疗能够降低胃癌风险。同时,胃复春治疗显著升高GIM患者胃黏膜鞘脂菌属丰度,研究发现鞘脂菌属可降解具有细胞毒性和致癌性的外源性芳香烃类化合物,其丰度与进展期胃腺癌显著负相关[17],鞘脂菌属可能是GIM消退的胃黏膜标志菌属[18]。因此,胃复春治疗能够改善GIM患者胃黏膜菌群,降低胃癌发生风险。

进一步分析胃黏膜菌群KEGG功能预测,胃复春治疗后,ABC转运蛋白、脂类代谢和脂肪酸代谢功能显著增强。研究表明,ABC转运蛋白在细胞中参与代谢解毒、脂质稳态平衡(如高密度脂蛋白的合成)、病毒防御等重要生理过程,与肿瘤多药耐药性相关[19]。前期研究显示,舌苔脂质代谢紊乱是胃癌前病变的重要特征[20]。现代研究认为,脂质代谢紊乱是“痰浊”“瘀血”的重要物质基础[21],胃复春治疗萎缩性胃炎癌前病变脾胃虚弱证、胃络瘀血证患者更具优势[12]。胃复春组方源于“养正积自除”理论,以扶正为主,攻补兼施,共同实现“治、养、护”一体,共奏健脾益气、活血解毒之功效,因此,胃复春临床不仅适用脾胃虚弱证,也应适用胃络瘀血证[22]。本研究结果提示,胃复春防治GIM可能与增强脂质代谢功能相关,体现了胃复春活血化瘀功效,为拓展胃复春的临床适应证提供了新的证据。

中医认为,脾气虚损,则运化无权、升降失司,水谷精微代谢失常则聚湿成痰;气为血帅,气行则血行,气虚则推动无力,血行不畅,瘀血内阻,痰湿瘀浊滋生[23]。故推测,胃复春补气健脾、活血益气,可能与增强胃部黏膜血液循环、缓解胃黏膜充血缺氧相关。研究显示,胃复春入血成分以香茶菜二萜类成分为主,网络药理学分析发现磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B、酪氨酸激酶-信号转导子与转录激活子、缺氧诱导因子-1、血管内皮生长因子、Wnt、表皮生长因子受体、p53 信号通路可能是胃复春有效治疗GIM的关键通路,分子对接分析显示,槲皮素、橙桑黄酮F、蓝萼甲素、香茶菜素O、香茶菜素U、蓝萼乙素、5-去甲基川陈皮素、冬凌草素等成分通过调控胃黏膜肠化生组织增殖、凋亡过程发挥逆转GIM作用[24],但尚未见胃复春改善胃菌群的功效物质基础研究,本研究为揭示胃复春防治胃癌前病变的微生态机制提供了临床证据。

综上,胃复春治疗GIM有效,与改变胃黏膜菌群、增强脂类代谢、脂肪酸代谢功能相关,然而,胃菌群易受环境、宿主状态、季节等干扰,故研究结果需要多中心、更大样本量验证。在未来的研究中,需要在体内外水平深入揭示胃复春逆转GIM的药效物质基础,为临床应用胃复春防治胃癌前病变提供科学证据。