基于谱效关系的昆布自由基清除活性成分研究*

黄华花，郑姗姗，许燕瑜，郑淑文，陈泓旭

（厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室/福建省中药精加工与健康产品开发重点研究室，福建 厦门 361023）

昆布为海带科植物海带Laminaria japonica Aresch.的干燥叶状体[1]，药食两用，多分布于辽宁、山东、浙江、福建等地。现代研究表明，昆布具有抗氧化[2-3]、抗肿瘤[4-5]、免疫调节[6]等药理作用，其含有的多糖类[7]、类胡萝卜素类[8]、多酚类[9]活性成分可能是其发挥上述药理作用的重要物质基础。关于昆布的抗氧化研究目前主要集中在昆布多糖[10]、昆布多酚[9]，而抗氧化活性成分研究仅证实了岩藻黄质的抗氧化作用[11]。因此，本研究在现有昆布指纹图谱研究[12]的基础上，对不同产地昆布化学成分和自由基清除活性进行谱效关系研究，筛选昆布自由基清除活性的有效成分群，为后期昆布抗氧化活性成分的筛选提供参考。

1 材 料

1.1 仪器 多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GO1510型全波长酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；ME204型电子天平、XPE105型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 药材与试剂 11批昆布样品产地信息见表1，经厦门医学院鲍红娟副教授鉴定为昆布Laminaria japonica Aresch.正品。2,2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（批号：H09N11B130256）、1,1-二苯基-2-苦基肼（批号：W27F10E81251）均购于上海源叶生物科技有限公司；维生素C（VC）（批号：1140552011）购于石药集团维生药业（石家庄）有限公司；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）（批号：B2124221）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、过硫酸钾均为分析纯，购于西陇科学股份有限公司。

表1 样品产地信息

2 方 法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取昆布样品适量，粉碎，过40目筛，取2.5 g，精密称定，精密加入甲醇10 mL，超声（功率：900 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，滤过，即得[12]。

2.1.2 阳性对照液的制备 取VC、Trolox对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成质量浓度分别为0.500 0、0.415 0 mg/mL的阳性对照液，即得。

2.1.3 DPPH溶液的制备 取DPPH适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.05 mg/mL的DPPH储备液，阴暗处放置。

2.1.4 ABTS溶液的制备 取ABTS、K2S2O4适量，精密称定，加蒸馏水制成浓度分别为7、140 mmol/L的溶液。取K2S2O4溶液440 μL与ABTS溶液25 mL混合，摇匀，阴暗处反应12～16 h，用甲醇稀释至734 nm处吸光值为0.6～0.8。

2.2 自由基清除活性测定

2.2.1 DPPH自由基清除活性测定及IC50的计算 分别精密吸取“2.1.1”项下供试品溶液及“2.1.2”项下VC阳性对照液，加甲醇按一定比例稀释成5个系列浓度的溶液。按要求精密吸取各溶液，分别混匀，阴暗处反应30 min，于517 nm处测定吸光度，按下式计算清除率：

其中，Ai为各溶液100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度，Aj为各溶液100 μL+甲醇100 μL的吸光度，A0为甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度。

运用SPSS Statistics 17.0软件进行probit回归，预测样品的半数抑制质量浓度（The half inhibiting concentration，IC50），其值越小，表明自由基清除活性越强。

2.2.2 ABTS自由基清除活性测定及IC50的计算 按“2.2.1”项下方法，以Trolox为阳性对照液，于734 nm处测定吸光值，计算ABTS自由基清除率并预测样品的IC50。

2.3 谱效关系分析

2.3.1 灰色关联度分析法 利用Excel 2019[13]，使用均值法对各批昆布样品特征峰的峰面积和清除自由基作用的IC50进行无量纲化处理；将变换后的清除自由基作用的IC50作为母序列记为Y0（m），特征峰峰面积作为子序列记为Yi（m）；求母序列与子序列的绝对差值Δoi（m），Δoi（m）=|Yo（m）-Yi（m）|，其中1≤i≤m；计算相应的关联系数Loi（k），Loi（k）=（Δmin+ρΔmax），其中ρ为分辨系数，本试验中ρ取0.5；再计算关联度其中N为子序列数据个数；最后将关联度排列，形成关联序。关联度反映了母序列和子序列的相关性，其中关联度＞0.6时，表明有关联性；关联度＞0.8时，表明有较大关联性。因此可根据关联度排序结果筛选出与自由基清除活性相关的特征峰。

2.3.2 偏最小二乘回归分析法 将各批昆布样品特征峰的峰面积作为自变量（X），清除自由基作用的IC50作为因变量（Y），利用SIMCA-P 14.1软件，建立偏最小二乘回归方程，分别筛选出与自由基清除活性相关的特征峰。

3 结 果

3.1 指纹图谱研究 前期研究建立了11批昆布样品的超高效液相（Ultra performance liquid chromatography, UPLC）指纹图谱[12]，确定了33个共有峰。（见图1～2、表2）

图1 样品UPLC 叠加指纹图谱

图2 样品UPLC 对照指纹图谱

表2 各共有峰的峰面积

3.2 自由基清除活性测定结果 11批昆布样品对DPPH自由基、ABTS自由基均表现出良好清除活性。DPPH自由基清除活性的强弱依次为S1＞S8＞S3＞S6＞S5＞S11＞S2＞S4＞S9＞S7＞S10，ABTS自由基清除活性的强弱依次为S1＞S8＞S7＞S5＞S3＞S2＞S11＞S6＞S10＞S4＞S9。（见图3～4）

图3 样品DPPH 自由基与ABTS 自由基清除活性比较

图4 样品清除自由基作用的IC50 比较

3.3 谱效关系分析

3.3.1 灰色关联度分析法 按“2.3.1”项下方法计算关联度，昆布样品UPLC指纹图谱与清除DPPH自由基活性关联度见表3。排序结果为：X24＞X21＞X22＞X4＞X27＞X28＞X23＞X29＞X9＞X18＞X17＞X12＞X25＞X20＞X10＞X2＞X33＞X31＞X5＞X19＞X6＞X3＞X13＞X14＞X16＞X32＞X15＞X11＞X26＞X8＞X1＞X30＞X7，其中X24、X21、X22、X4、X27、X28、X23、X29、X9、X18、X17、X12、X25、X20、X10的关联度＞0.8[14]，因此认为这些特征峰对清除DPPH自由基的贡献程度较大。

表3 样品UPLC指纹图谱与清除DPPH自由基活性关联度

昆布样品UPLC指纹图谱与清除ABTS自由基活性关联度见表4。排序结果为：X18＞X22＞X9＞X4＞X24＞X12＞X17＞X27＞X20＞X33＞X21＞X10＞X28＞X2＞X29＞X6＞X19＞X3＞X16＞X30＞X23＞X13＞X5＞X25＞X14＞X31＞X3＞X11＞X15＞X1＞X26＞X8＞X7，其中X18、X22、X9、X4、X24、X12、X17、X27的关联度＞0.8，因此这些特征峰对清除ABTS自由基的贡献程度较大。

表4 样品UPLC 指纹图谱与清除ABTS 自由基活性关联度

3.3.2 偏最小二乘回归分析法 按“2.3.2”项下方法建立回归方程，昆布样品清除DPPH自由基的标准回归系数结果见图5A，得偏最小二乘回归方程：

图5 样品清除DPPH 自由基的标准回归系数图和VIP 贡献图

Y=-0.180 2X1+0.403 8X2+0.030 3X3+0.239 8X4-0.324 2X5+0.221 8X6-0.289 7X7-0.538 0X8+0.575 3X9-0.151 8X10+0.028 7X11+0.3533X12+0.0719X13+0.3891X14+0.0071X15+0.0887X16-0.0569X17-0.1244X18-0.0032X19+0.6002X20-0.1663X21+0.0658X22+0.6027X23-0.561 3X24+0.016 4X25+0.017 0X26-0.123 4X27-0.456 0X28-0.132 8X29-0.098 6X30+0.126 5X31+0.561 5X32+0.131 6X33。回归系数的绝对值越大，表明对因变量（IC50）的影响越大[15]。因IC50值越小，DPPH自由基清除活性越强。其中X1、X5、X7、X8、X10、X17、X18、X19、X21、X24、X27、X28、X29、X30的回归系数＜0，表明这些特征峰对昆布清除DPPH自由基作用有贡献。

与此同时，变量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）越大，说明其对因变量的解释能力越强[16]。VIP分析结果见图5B。其中X23、X28、X32、X33、X2、X14、X20、X24、X27、X31、X26、X25、X29、X30、X8、X18的VIP值＞1，且X28、X24、X27、X29、X30、X8、X18的相关系数＜0，表明这些特征峰所代表的化学物质可能是昆布清除DPPH自由基作用的物质基础。

按“2.3.2”项下方法建立回归方程，昆布样品清除ABTS自由基的标准回归系数结果见图6A，得偏最小二乘回归方程：Y=0.017 5X1+0.180 1X2-0.023 3X3+0.167 2X4-0.044 1X5-0.024 6 X6-0.110 2X7-0.106 7X8+0.189 4X9+0.132 8X10+0.043 4X11+0.103 2 X12-0.0349X13+0.1054X14-0.0840X15+0.0672X16-0.0051X17-0.2144 X18+0.0830X19+0.2776X20+0.0698X21+0.0872X22+0.3375X23-0.6773 X24-0.0644X25+0.0795X26+0.0797X27+0.0290X28-0.0576X29-0.465 1 X30+0.320 2X31+0.778 8X32-0.400 1X33。其中X3、X5、X6、X7、X8、X13、X15、X17、X18、X24、X25、X29、X30、X33的回归系数＜0，表明这些峰对昆布清除ABTS自由基作用有贡献。

图6 样品清除ABTS 自由基的标准回归系数图和VIP 贡献图

VIP分析结果见图6B，其中X23、X31、X32、X30、X25、X1、X2、X18、X14、X24、X33、X17、X28的VIP值＞1，且X30、X25、X18、X24、X33、X17的相关系数＜0，表明这些特征峰所代表的化学物质可能是昆布清除ABTS自由基作用的物质基础。

4 讨 论

4.1 抗氧化方法的选择 目前常用的抗氧化评价方法有DPPH法、ABTS法、FRAP法、超氧阴离子自由基清除法、羟自由基清除法等[17-18]。DPPH法用于体外测定物质总抗氧化能力，是目前使用最为广泛的检测自由基清除能力的方法之一；ABTS法简单快捷，不仅可测定水溶性及脂溶性天然产物抗氧化活性，还可测定酸性、中性及弱碱性化合物的自由基清除能力。本研究采用这两种方法来综合评价昆布样品的自由基清除活性，能够获得比较客观真实的自由基清除活性评价。

4.2 分析方法的选择 目前常用的数据分析方法有偏最小二乘回归分析法、灰色关联度分析法、多元线性回归分析法、主成分分析法、聚类分析法等[19]。偏最小二乘回归分析法融合了主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析3种分析手段，能够在模型自变量存在严重多重相关性且样本量较少的情况下进行回归分析[20]；灰色关联度分析法来源于灰色系统理论，因其具有模糊性的特点而广泛应用于中药谱效关系、质量评价研究中[21-22]。本研究采用灰色关联度结合偏最小二乘回归分析法，可以较为科学、合理地筛选出与昆布自由基清除活性相关的成分。

本研究在前期已建立的昆布UPLC指纹图谱基础上，通过DPPH与ABTS法测定11批昆布样品自由基清除活性的IC50，并采用灰色关联度结合偏最小二乘回归分析法构建昆布自由基清除活性谱效关系。灰色关联度法和偏最小二乘回归法结果均表明特征峰X18、X24对昆布清除自由基作用有贡献，其代表的成分可能为昆布清除自由基作用的主要活性成分。