基于HPLC指纹图谱与近红外光谱模型评价祖师麻膏药质量*

董欣昱，张生杰，庞文娟，王 丽，田志梅，曹雪芹，刘小华

（武威市药品检验检测中心，甘肃 武威 733000）

祖师麻膏药传承了具有两千多年历史的黑膏药工艺，以中药祖师麻为主要原料，由“炼油下丹”“去火毒”“烊化摊涂”等传统工艺制备而成[1]。祖师麻膏药对风湿性关节炎、类风湿关节炎及中医痹病寒湿阻络证、瘀血阻络证疗效较好，尤其对湿寒阻络、瘀血阻络引起的肢体关节冷痛、沉重痛、关节发凉、肿胀、肌肉关节剧痛疗效显著[2]。现代临床研究发现，祖师麻膏药短期应用与吲哚美辛巴布膏止痛效果相当，贴敷24 h可明显缓解患者步行、上楼、繁重家务劳动时的关节、肌肉疼痛，其作用优于吲哚美辛巴布膏，但部分患者使用祖师麻膏药后会有轻微的局部皮肤刺激症状[3-4]。研究发现，祖师麻酯类提取物和醇提取物都有显著的镇痛、抗炎作用[5]。网络药理学相关研究显示，祖师麻治疗类风湿关节炎具有多成分、多靶点、多途径等作用的特点[6]。

高效液相色谱（HPLC）指纹图谱因灵敏度高、检出限低、重复性好等优点，已被广泛用于中药质量的评价研究[7-8]。但是HPLC指纹图谱容易受到实验条件变化的影响，这给中药质量评价带来了一定的干扰[9]。近红外光谱技术（NIRS）是一种环保、高效、便捷、无损、准确的绿色定性、定量分析技术，因其独特的优势被广泛应用于中药、化学药物、生物制剂等药物的定性定量分析、制剂生产过程控制及药品监管等多个领域[10-12]。张振宇等[13]建立的近红外光谱定量模型，实现了干姜多个活性成分含量的快速预测。利用近红外光谱技术可以进行中药真伪鉴别，贵重药材和不同产地药材的快速无损检测，以及药品生产过程中的质量控制[14-18]。这两种不同化学信息的综合质量评价方法在中药质量评价中都被广泛应用，但能否相互替代或者相互补充尚未有相关报道。本研究为了对祖师麻膏药生产全过程进行质量控制，分别采用HPLC指纹图谱和近红外光谱模型进行祖师麻膏药质量评价。

1 材 料

1.1 主要仪器 Agilent1260Ⅱ型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Bruker Matrix-F型近红外光谱仪（德国布鲁克公司）；MS205D型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 药物与试剂 祖师麻甲素（批号：110900-201607，含量：98.8%）购于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱级，批号：JA086330）购于德国Merck 公司；磷酸（色谱纯，批号：J2111704）购于阿拉丁；祖师麻膏药（规格：每张净重10 g；批号：20220509，20220415，20220614，20220505，20220401，20220606，20220510，20220611，20220607，20220603，20220504）均购于甘肃泰康制药有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.2 对照品溶液的制备 精密称取祖师麻甲素对照品12.10 mg，置100 mL容量瓶中，用85%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3 供试品溶液的制备 将样品置-20 ℃冰箱放置过夜，取出后迅速除去背衬，立即粉碎成粗粉，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50 mL，密塞，称定质量，先用力振摇10 min，再超声处理（功率：150 W，频率：50 kHz）1 h，放冷，称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性试验 取样品溶剂空白、祖师麻甲素对照品溶液、供试品溶液各20 μL，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，结果在供试品色谱中各待测成分色谱峰分离度均大于1.5，其他杂质峰对祖师麻甲素无干扰。（见图1）

图1 HPLC 图

2.4.2 线性关系考察 精密量取“2.2”项下祖师麻甲素对照品溶液，依次用甲醇溶液稀释并制备成质量浓度为30.25、24.20、18.15、12.10、6.05 μg/mL系列对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标进行线性回归分析，得回归方程Y=4 260.3X-4.5（r=0.999 8），表明祖师麻甲素在6.05～30.25 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 称取祖师麻膏药（批号：20220509）约5.0 g，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，以“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录样品溶液峰面积。结果表明祖师麻甲素峰面积的RSD值为0.90%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液，分别在2、4、8、10、12、24 h后，以“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果供试品溶液在24 h内祖师麻甲素峰面积的RSD值为1.17%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

WAP终端设备的处理能力较低，且无线网络数据传输带较窄，所以WPKI与传统PKI技术有很大的区别，WPKI系统对数据和加密的简洁性要求较高。两者在编码方法、证书格式、加密算法和密钥中均存在一定的差异性。

2.4.5 重复性试验 称取祖师麻膏药（批号：20220509）6份，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，测定祖师麻甲素峰面积，采用外标法计算祖师麻甲素含量，平均含量为126 μg/g，RSD值为1.21%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知祖师麻甲素含量的祖师麻膏药（批号：20220509）6份，每份约5.0 g，精密称定，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，分别精密加入祖师麻甲素约为供试品溶液中待测成分含量77%、96%、134%的对照品各2份，进样分析采集祖师麻甲素峰面积代入线性方程计算相应含量，并计算平均加样回收率和RSD值。结果表明祖师麻甲素平均加样回收率为99.30%，RSD值为1.79%，表明方法准确度良好。（见表1）

表1 祖师麻甲素加样回收率试验结果 （n=9）

2.5 祖师麻甲素含量测定 取25批祖师麻膏药样品，每批样品按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样分析，每份样品测定2次祖师麻甲素峰面积，用平均峰面积按外标法计算含量，结果见表2。

表2 样品测定平均结果 （n=2）

2.6 HPLC指纹图谱建立

2.6.1 指纹图谱的建立 取25批祖师麻膏药，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采集25批祖师麻膏药色谱图，将HPLC法采集到的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）》软件，以S1为参照指纹图谱，采用多点校正后进行全谱峰自动匹配，并叠加指纹图谱和对照指纹图谱。（见图2）从25批祖师麻膏药的指纹图谱中，标记出10个共有峰。（见图3）通过与祖师麻甲素对照品出峰时间和光谱图参比确认祖师麻甲素峰（峰8）。计算共有峰与对照指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积，结果发现10个共有峰的保留时间RSD值小于0.5%，表明方法的重复性较好、方法稳定，可用于祖师麻膏药质量考察；峰面积RSD值为25.5%～37.7%，其中标志性成分祖师麻甲素峰面积RSD值为28.5%，说明通过HPLC分析不同批次祖师麻膏药化学成分含量存在显著差异。

图2 25 批祖师麻膏药色谱峰匹配图

图3 祖师麻膏药共有模式图谱

2.6.2 相似度评价 将25批祖师麻膏药色谱图.cdf数据文件，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.1版本）》软件，计算各样品间图谱的相似度，结果25批样品间的平均相似度为98.52%，RSD值为1.50%。（见图3）指纹图谱相似度分析结果显示，祖师麻膏药指纹图谱一致性较好。（见表3）

表3 不同批次祖师麻膏药HPLC 指纹图谱相似度与NIR 平均光谱相似度

2.7 红外光谱相关系数模型建立

2.7.1 样品近红外光谱采集 分别取25批祖师麻膏药，在Matrix-F型傅里叶变换近红外光谱仪扫描近红外光谱，环境温度18～30 ℃，空气湿度＜70%，波数范围为4 000～12 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，每个样品平行测定3次，扫描次数为75次，样品不用去除外包装，直接接触测定，软件为OPUS 5.5。（见图4）

图4 样品近红外光谱图

2.7.2 相关系数模型的建立 将采集到的25批祖师麻膏药的75张近红外光谱图全部导入OPUS 5. 5分析软件求得平均光谱。（见图5）以平均谱图作为参考光谱建立相关系数模型。建模参数条件为：预处理方法为二阶导数化+矢量归一化，平滑点数17个，谱段为6 200～5 500 cm-1、5 000～4 700 cm-1，阈值为99%。各批次样品与NIR平均光谱相似度结果显示25批祖师麻膏药在阈值99%时全部通过验证，平均相似度99.90%，RSD值为0.02%，表明25批祖师麻膏药相似度较高，质量稳定。（见表3）

图5 平均光谱图

2.8 红外光谱一致性评价模型建立

2.8.1 一致性评价模型建立 用其中20批祖师麻膏药的60张近红外光谱图来建立一致性评价模型，将60张近红外光谱图导入OPUS 5. 5分析软件，建立一致性评价模型。建模参数条件为：光谱图预处理方法为二阶导数化+矢量归一化，平滑点数13个，谱段为9 000～7 500 cm-1、6 900～5 600 cm-1、5 000～4 250 cm-1，一致性指数限度CI设置为7。

2.8.2 一致性评价模型验证 另取5批祖师麻膏药样品的15张近红外光谱图作为检验光谱，将15张近红外光谱图导入模型以验证所建一致性评价模型的可靠性，检验光谱应全部落入CI限度之内，方可认为模型通过验证。验证结果显示，蓝色点标注的检验光谱，全部落入红色限度线之内。（见图6）表明所建模型通过验证，模型能够对祖师麻膏药进行一致性评价。验证结果显示，绝大多数点落在CI限度2～4之间，说明祖师麻膏药质量较稳定。

图6 一致性评价模型验证图

3 讨 论

3.1 祖师麻膏药样品的预处理 祖师麻膏药质量标准要求，在测定祖师麻甲素时，需将样品在0 ℃下预处理后进行粉碎。实际试验过程发现，0 ℃预处理不能使祖师麻膏药基质完全固化。粉碎时产生的热量使膏药基质融化，不便于样品取样和称量，同时膏状黏稠基质很难在提取溶剂中溶散，以致影响含量测定的准确性。本试验将样品在-20 ℃条件下过夜处理后，用粉碎机粉碎成粗粉，迅速取样并在提取溶剂中溶散，以确保取样的代表性。

3.2 祖师麻甲素含量的稳定性 本研究通过HPLC法测定25批祖师麻膏药中祖师麻甲素的含量，结果显示不同批次祖师麻甲素含量差异很大，RSD值为28.5%，但标准只规定了祖师麻甲素含量下限，不得少于60 μg/g。测定结果显示，祖师麻膏药含量均合格。指纹图谱相似度分析显示，共有峰的保留时间RSD值小于0.5%，说明方法的重复性较好，但峰面积RSD值为25.5%～37.7%，说明不同批次祖师麻膏药化学成分含量存在显著差异。为研究其原因，本研究采用近红外光谱相关系数模型和一致性评价模型研究不同批次祖师麻膏药质量的稳定性。

3.3 建立近红外光谱模型评价祖师麻膏药质量 近红外光谱相关系数模型是一种简单易行的质量控制方法，即将某张光谱与一张参考光谱进行比较，计算两张光谱在所选谱段内各波长点吸光度之间的相关系数（r）来反映两张光谱的相似程度[19]。本试验采用25批次样品的平均光谱作为参照光谱建立相关系数模型。相关系数模型分析显示，25批祖师麻膏药的平均相似度99.90%，RSD值为0.02%，表明不同批次间祖师麻膏药相似度较高，质量稳定。一致性评价模型检验是一种快捷的图谱比较方法，用于比较未知光谱与某一组参考光谱是否具有一致性，同时能研究不同批次间药品质量稳定性[20-21]。一致性评价模型分析显示，在一致性指数限度7以内，25批次祖师麻膏药全部通过验证，表明25批次祖师麻膏药质量稳定。

3.4 祖师麻膏药中祖师麻甲素含量差异的原因 近红外模型分析结果和指纹图谱相关系数研究表明，25批祖师麻膏药质量较稳定，造成HPLC法含量测定共有峰峰面积偏差大的原因主要是在制备供试品溶液的过程中，膏药基质黏稠不易溶散，同时在用力振摇的过程中，力度和速率的不同影响溶散效果，以致提取溶剂不能将祖师麻甲素提取充分，造成不同样品间含量测定结果偏差较大。为解决此问题，应事先将祖师麻膏药进行低温预处理，温度越低越容易粉碎，同时在溶散过程中尽量避免人员误差，采用摇床震荡或采用冷冻粉碎技术避免对膏药基质的影响。

3.5 近红外光谱技术在药品质量评价中的优势 近红外光谱可在无损伤样品的情况下，快速对样品进行化学信息的表征分析，而且不需要对样品进行化学处理。该技术无污染、方便快捷，往往只需要几十秒的时间就可以获得样品近红外吸收光谱，同时在计算机分析软件的支持下，可实现建立近红外光谱模型、快速分析样品光谱的功能。本研究建立了祖师麻膏药的相关系数模型和一致性评价模型，均可用于评价祖师麻膏药质量的稳定性，可以避免液相色谱技术在样品处理过程中造成的偏差，同时近红外光谱技术还可以应用于祖师麻膏药生产全过程的质量控制。