未折叠蛋白反应和内质网自噬与骨质疏松症关系的研究进展

孟世龙 童铭豪 张徐 符新蕾 余阳 张伟 史晓林 刘康,*

1.浙江中医药大学第二临床医学院,杭州 310053

2.福建中医药大学第一临床医学院,福州 350000

3.浙江中医药大学附属第二医院仙居分院,台州 317300

4.浙江中医药大学附属第二医院,杭州 310005

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质合成、折叠和分泌的主要部位,在细胞生命活动中扮演着重要的角色[1]。ER在合成蛋白质的过程中,正确折叠的蛋白会被运出腔外,而未折叠/错误折叠的蛋白则留在腔内被进一步降解[2]。在某些因素影响下,内质网折叠功能发生紊乱,造成大量未折叠/错误折叠蛋白累积,进而诱发内质网应激。

ER主要通过3种传感蛋白来感知应激压力:肌醇需要酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)、双链RNA活化蛋白激酶样内质网激酶(PRK-like ER kinase,PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。在识别应激压力后,它们可以诱导未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)[3]。UPR是缓解内质网应激压力、恢复ER结构和功能的主要途径[4]。内质网自噬在缓解ER压力、维持ER结构和功能方面与UPR相辅相成,也发挥着重要作用[5]。一方面,内质网自噬可以降解UPR途径中不能清除的错误折叠蛋白以及部分ER。另一方面,内质网自噬还可通过扩大内质网容量,减轻内质网自身负荷,从而缓解应激压力[6]。此外,长期或高强度的内质网应激状态可能会诱导细胞凋亡[7]。

骨骼是一个动态的、代谢活跃的、功能多样化的器官,主要由细胞外基质蛋白和磷酸钙组成[8]。骨代谢过程主要由成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收调控,共同维持骨矿物质的密度和代谢平衡[9]。骨代谢一旦失衡,继而会导致一系列代谢性骨病。其中,骨质疏松症(osteoporosis,OP)是老年群体中常见的骨代谢疾病,主要以骨量降低和骨组织细微结构破坏为特点[10]。近来有研究表明[11-12],UPR信号传导和内质网自噬与OP之间存在密切联系。此外,内质网应激下的UPR以及内质网自噬也是维持ER结构和功能的重要途径[13-14]。其中,内质网自噬在OP领域的研究内容较新、相关研究较少。因此,本研究将主要从UPR的3种激活途径来阐述UPR和OP之间的关系及作用机制。

1 UPR的激活途径

在内质网未应激状态下,ER腔内的蛋白质结构域和免疫球蛋白结合蛋白质(binding protein for immunoglobulins,BIP)或78000调节蛋白(glucose regulated protein of 78000,GRP78)结合,阻止相应的传感蛋白激活;在内质网应激状态下,BIP与腔内的蛋白质结构域解离,启动内质网应激[15]。

1.1 IRE1α信号通路

未折叠/错误折叠蛋白累积过量时,通过BIP释放压力信号,促使IRE1α聚合并自磷酸化,进而激活其蛋白激酶活性和核酸内切酶。IRE1α通过核酸内切酶从X盒-结合蛋白1上(X box-binding protein 1,XBP1)切除26核苷酸内含子,产生转录蛋白XBP1s(X box-binding protein 1 splicing)。随后,XBP1s转移至细胞核内并与内质网应激反应元件(ER stress response element,ERSE)的基因启动子结合,激活UPR靶基因和内质网相关降解途径,缓解内质网应激[15-16]。

1.2 PERK信号通路

内质网应激启动后,PERK与真核生物起始因子2的α亚基(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)结合,并使其磷酸化[17]。磷酸化的eIF2α能够抑制蛋白质翻译,进而缓解内质网应激。此外,磷酸化的eIF2α还可诱导转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的表达。ATF4可以增强生长停滞与DNA损伤诱导蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34,GADD34)的活性,导致eIF2α去磷酸化以及恢复ER的蛋白质合成水平[18]。

1.3 ATF6信号通路

感受到应激压力后,ATF6通过囊泡运输到高尔基体,随后被S1P和S2P蛋白酶依次剪切处理[19]。经过剪切处理后的N端细胞质片段ATF6p50转移到细胞核激活UPR靶基因,发挥与IRE1α-XBP1类似的作用[20]。此外,ATF6家族中的其他转录因子具有与ATF6类似的结构,如老年星形胶质细胞特异性诱导物质(OASIS)、cAMP应答元件结合蛋白H(CREBH)、CREB3以及CREB4。在内质网应激状态下,它们也会发挥类似ATF6的作用。

2 UPR和骨质疏松症之间的关系

2.1 UPR调节成骨生成及分化

2.1.1IRE1信号通路:目前,IRE1-XBP1信号通路和成骨分化的相关研究较少,且部分研究之间存在争议。Tohmonda等[21]研究表明,IRE1-XBP1通路可以促进成骨细胞分化。他们在骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)成骨分化的过程中发现,成骨分化过程伴随着XBP1 含量、骨形成转录因子Osx表达、胶原蛋白I和骨钙素的生物合成以及碱性磷酸酶活性的增高。随后,他们敲除IRE1蛋白发现,BMP2诱导成骨分化的过程中未见碱性磷酸酶活性增加,并且骨唾液蛋白(BSP)、胶原蛋白I和骨钙素均有不同程度的降低,提示IRE1的缺失会抑制成骨细胞分化。而Guo等[22]报告了相反的结果,在IRE1敲低的情况下,BMP2诱导的C2C12系间充质干细胞分化为成骨细胞的作用增强。

2.1.2PERK信号通路:PERK-eIF2α-ATF4通路在成骨细胞分化以及骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化的过程中扮演着重要的角色。Zhang等[23]研究发现,甲状旁腺激素(PTH)刺激成骨细胞分化和增殖的分子机制与PERK-eIF2α-ATF4信号通路存在一定的联系。Li等[24]研究表明,PERK-eIF2α通路在维持BMSC衰老表型中发挥着重要作用。通过salubrinal(eIF2α去磷酸化的抑制剂)激活eIF2α信号有助于衰老BMSC的清除和改善老年小鼠的骨完整性。此外,ATF4在成骨分化中也发挥着重要作用,而PERK对于激活ATF4至关重要[25]。ATF4不仅能够诱导骨钙素合成、加速骨质矿化,还位于诸多调控成骨分化通路的下游。有研究证实[26-27],缺乏PERK基因的小鼠会出现严重的骨质减少,主要表现为骨皮质厚度、基质矿化程度以及骨小梁体积和厚度均有不同程度的降低。相反,携带ATF4基因载体的小鼠成骨细胞,碱性磷酸酶活性和基质矿化可以恢复到正常水平[27]。ATF4调节成骨分化的机制还与β-连环蛋白和CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP)有关。ATF4通过诱导细胞分化所需的β-连环蛋白合成,进而促进成骨分化。但是CHOP对成骨分化的作用还存在争议。CHOP是内质网应激诱导的细胞凋亡调节因子,Zhou等[28]研究发现,褪黑素可以通过抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号轴,下调CHOP的表达,抑制内质网应激介导的成骨细胞凋亡。Guo等[29]研究也发现,高剂量的地塞米松(Dex)可以通过提高CHOP表达,从而诱导成骨细胞凋亡。但有研究发现[30],CHOP在成骨细胞表型正常表达中是必需的,同时还能促进成骨细胞生成。

2.1.3ATF6信号通路:ATF6可以诱导骨钙素合成,从而参与成骨分化的调控过程[31]。BMP2诱导成骨分化的过程也涉及ATF6,BMP2通过加强Runx6与ATF3启动子的结合,进而提高ATF6的表达和活化。此外,ATF6家族的转录因子OASIS能够通过UPR激活Collal基因转录,进而合成胶原蛋白Ⅰ。研究发现[32],缺乏OASIS基因的小鼠由于成骨细胞分化延迟,最终发展为严重的骨质减少症。其中,最显著的特征是胶原蛋白Ⅰ减少。目前,关于ATF6及其家族转录因子在成骨分化的作用仍需进一步研究。

2.2 UPR调节破骨细胞生成及分化

2.2.1IRE1α-XBP1信号通路:IRE1α-XBP1通路主要通过诱导RANKL表达或直接结合NFATc1促进破骨细胞生成[20]。RANKL/RANK诱导的钙振荡对破骨细胞的形成非常重要。研究发现[33],钙振荡可以通过肌醇1,4,5-三磷酸受体2(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors 2,ITPR2)和ITPR3诱导IRE1α-XBP1信号通路的激活,进而促进NFATC1转录以及小鼠破骨细胞分化。但是在没有ITPR2和ITPR3参与的情况下,细胞中还检测到较低水平的XBP1。提示除ITPR2和ITPR3以外的钙通道或其他机制,也可能参与RANKL诱导的内质网应激。

此外,IRE1α-XBP1通路还可参与炎症因素介导的骨流失过程。磨损颗粒引起的假体无菌松动和假体周围骨溶解是关节成形术的主要并发症。研究发现[34],内质网应激可以通过BIP-IRE1α通路及下游的c-Fos、NF-kB和Ca2+等信号因子,介导假体周围磨损颗粒诱发炎性骨溶解和破骨生成。Wang等[35]也发现,内质网应激可以通过促进炎症反应介导磨损颗粒促进破骨细胞形成和骨溶解。以上研究表明,IRE1α-XBP1通路可参与不同机制诱导的骨流失,并在破骨细胞形成以及骨吸收过程中发挥了积极作用。

2.2.2PERK-eIF2α信号通路:PERK-eIF2α通路在破骨细胞成熟分化过程中也扮演着重要的角色。研究表明[36],在破骨细胞分化过程中,伴随着UPR的短暂激活。Guo等[37]也发现,PERK可以通过激活NF-κB和MAPK通路,调控RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收。此外,他们还发现活性氧(ROS)可以诱导内质网应激,从而增强PERK磷酸化并进一步促进自噬以诱导破骨形成。Xu等[38]研究发现,硼酸可以抑制RANKL诱导的PERK-eIF2α通路活化,显著阻止脂多糖(LPS)诱导的骨质流失。

Salubrinal是eIF2α去磷酸化的抑制剂,可有效缓解小鼠骨量丢失。Li等[39]在小鼠废用骨质疏松症模型中发现,eIF2α表达水平与成骨细胞计数呈正相关,与破骨细胞计数呈负相关。Salubrinal可以增加eIF2α表达水平,并抑制RANKL、NFATc1、CTSK和CHOP的表达。此外,他们还在小鼠去卵巢骨质疏松模型中发现[40],Salubrinal通过抑制Rac1 GTP酶和NFATc1的活性来抑制TRAP和CTSK的表达,从而抑制破骨细胞的迁移、粘附。He等[41]也发现,Salubrinal可以作用于PERK-eIF2α信号通路,从而减少NFATc1的表达并抑制破骨形成。综上所述,PERK-eIF2α通路对破骨形成有积极影响,但是更详细的机制需要进一步探索和验证。

2.2.3ATF6信号通路/CREBH:目前,ATF6对破骨细胞的调控作用存在争议。但是AFT6家族转录因子CREBH已被证实可促进破骨细胞生成。Zheng等[42]研究表明,S1P可以促进破骨细胞生成。在S1P缺陷的破骨细胞中,S1P和ATF6的表达水平显著降低,但BIP、XBP1、PERK、ATF4等其他内质网应激相关蛋白的表达水平无显著变化。提示S1P可能通过其他机制调节破骨细胞分化和骨吸收。

CREBH作为AFT6家族的转录因子,在内质网应激中的作用机制类似ATF6。研究发现[3],CREBH激活后,其结构域可以进入细胞核中,通过与NFATC1结合并上调其表达水平,最终促进RANKL诱导破骨细胞形成。此外,在炎症因素介导的骨吸收过程中,炎症因子TNF-α通过NF-κB通路上调CREBH表达水平,进而抑制BMP2介导的骨形成,同时又能提高NFACT1的表达,促进破骨分化[18]。

3 内质网自噬和骨质疏松症之间的关系

内质网自噬是Bernales等[43]在研究UPR时发现并首次命名。内质网自噬是通过调节内质网碎片化,并将其转移至溶酶体进行清除的选择性自噬过程。目前,关于内质网自噬的相关研究主要以巨自噬为主,过程主要分为4个步骤[44]:①内质网自噬受体通过LC3、Atg8、GABARAP作用结构域与自噬双层膜相互作用,形成碎片从内质网上脱离;②自噬双层膜包裹内质网部分片段形成自噬小体;③自噬小体外膜与溶酶体融合;④溶酶体降解过程开始。

作为一种新发现的自噬类型,内质网自噬与OP之间也存在一定的联系。除自噬基础作用机制外,内质网自噬还可通过内质网自噬受体影响骨代谢过程。内质网自噬受体不仅可以识别ER腔内累积的蛋白或受损内质网,还能通过LC3、Atg8相互作用域与相关蛋白LC3/Atg8/GABARAP特异性结合,形成自噬体进而发挥降解作用[45]。根据目前研究[2],哺乳动物中内质网自噬受体主要包括FAM134B、RTN、ALT3、TEX264、SEC62、CCPG1 6种。成纤维细胞生长因子18(FGF18)通过FAM134B的TFEB/TFE依赖性转录调节特异性激活内质网自噬,这是骨化和骨骼发育的必需过程[46]。ATL可以调节脂质液滴大小并抑制骨形态发生蛋白(BMP)信号传导,但是具体作用机制尚不明确[47]。有研究指出,ATL3突变会导致感觉神经病变和骨质破坏[48]。CCPG1的跨膜域锚定在内质网膜上,胞质面含有两个FIP200互作区域(FIRs),胞质N端还有一个能与LC3/GABARAP互作的LIR[49]。其中,成骨细胞的FIP200的缺失会导致小鼠骨量减少以及骨骼发育受损,同时还伴有小鼠骨骼显著的机械性能改变,抵抗断裂的强度下降[41],而LC3的缺失会对破骨细胞骨吸收过程产生影响[42]。

综上所述,内质网自噬与OP之间存在着一定的联系。但是目前内质网自噬和疾病的相关研究主要集中在肿瘤、神经系统疾病等方面,在OP领域的研究很少,未来有待深入研究。

4 小结及展望

UPR的3条激活路径在骨代谢的调控过程中扮演着重要角色。其中,PERK信号通路的研究是最多、最为成熟的,在成骨和破骨分化中均发挥着重要作用。PERK通路的主要功能是促进破骨细胞分化,PERK位于RANKL-RANK介导的破骨发育信号通路的下游,与NF-kB、MAPK、ROS、Ca2+、NFATc1等信号因子之间存在密切的联系。在促进破骨分化方面,PERK通路存在巨大潜力,未来有待深入研究。此外,内质网自噬和骨代谢之间也有一定联系,但是其过程较为复杂,与ROS、炎症因素、内质网应激之间有着复杂的联系。目前该领域的研究内容较少、较新,仍有许多机制尚不明确,未来有待进一步研究补充。值得注意的是,内质网自噬受体CCPG1介导内质网应激状态下的内质网自噬,是两者之间联系的直接途径,未来有待深入研究。