甲基转移酶样蛋白14对急性早幼粒白血病细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的调节作用

张孟孟，伍燕平，张平平，王蒙，李佳佳

蚌埠医学院第一附属医院血液科，安徽蚌埠 233003

急性早幼粒细胞白血病（APL）占成人急性髓系白血病（AML）的5%～10%，是一种罕见但高度可治愈的AML，大多数APL 患者可通过联合全反式维甲酸和三氧化二砷疗法治愈，但仍有部分患者出现早期死亡和复发。目前对于APL 的发病机制及细胞分化的潜在机制仍未阐明。研究显示，N6-甲基腺苷（m6A）甲基化通过影响不同靶基因分子的翻译和稳定性，调控相关通路，参与AML 的发生发展［1］；而甲基转移酶样蛋白14（METTL14）通过增强m6A 甲基化，调控其靶点如MYB 和MYC 的表达，促进AML进展［2］。2022年9月—2023年6月，我们以急性早幼粒细胞株NB4 为研究对象，通过构建过表达及敲低的METTL14 转染NB4 细胞，检测细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的变化，为研究APL 的机制及临床治疗寻找新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人类早幼粒细胞株NB4 购自中国无锡Hasenbio公司。L-谷氨酰胺（美国Gibco公司），LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），质粒（中国上海GenePharma 公司），Transwell 小室（美国Corning公司）、CCK-8 试剂盒（日本Dojindo 公司），兔抗m6A抗体、山羊抗兔IgG。流式细胞仪（美国Bio-Rad 公司），酶标仪（美国Awareness 公司），电子显微镜（日本尼康公司）。

1.2 细胞培养 取NB4 细胞，加入含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的IMDM 培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h。

1.3 细胞分组与转染方法 按照说明书使用LipofectamineTM2000 转染试剂盒，取对数生长期的细胞以每孔1 × 105细胞接种于6 孔板，后续转染待细胞生长至70%以上融合时进行。将细胞分为过表达对照组、过表达组、干扰对照组、干扰组，其中过表达对照组及过表达组分别使用LipofectamineTM2000 试剂将空白质粒和METTL14质粒转染至细胞中，干扰对照组和干扰组分别使用LipofectamineTM2000 试剂将si-NC 和si-METTL14 转染至细胞中。转染完成后，置于37 ℃培养箱中继续培养48 h。

1.4 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。取对数生长期细胞，接种于96 孔培养板，调整细胞密度为1 × 104/孔。加入5 g/L MTT 溶液孵育4 h，离心弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振荡15 min。上酶标仪检测各孔490 nm 波长处的吸光度（OD）值，以OD值代表细胞增殖活力。

1.5 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞仪。取对数生长期细胞，以每孔1 × 105个细胞接种于24 孔培养板，终体积为500 μL。实验细胞分组及转染同前，转染48 h 后，收集细胞，用冷PBS 洗涤2 次后将细胞重悬于100 μL 的Binding Buffer，分别加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室温避光染色10 min，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 细胞迁移能力观察 采用Transwell 实验。取对数生长期细胞，Transwell 上室加入含2 × 105个细胞的无血清培养基，下室加入含20% FBS的培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h。迁移细胞使用4%甲醛固定，结晶紫染色10 min。显微镜下拍照并计数，随机选取5个视野取平均值，代表细胞迁移能力。

1.7 细胞侵袭能力观察 采用Transwell 实验。用40 μg Matrigel 包被24 孔板中的Boyden 小室，其余步骤与“1.5”相同。显微镜下拍照并计数，随机选取5个视野取平均值，代表细胞侵袭能力。

1.8 细胞m6A 甲基化水平检测 采用Dot blotting法。在真空下从变性和斑点RNA 样品中收集硝酸纤维素膜。UV 交联后，加入5% 脱脂奶粉在0.1% PBST 中封闭1 h。在4 ℃下将兔抗m6A 抗体（1∶500）添加到膜中过夜。洗涤后，将印迹与山羊抗兔IgG（1∶500）混合，25 ℃孵育1 h。使用Roche LightCycler®480Ⅱ成像系统进行扫描，以灰度值表示各组细胞m6A甲基化水平。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism5.0 统计软件。采用S-W 法对计量资料进行正态检验，符合正态分布的数据以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况比较 过表达对照组和过表达组的细胞增殖率分别为84.35% ± 2.09%、109.31% ± 1.57%，过表达组细胞增殖率高于过表达对照组（P＜0.01）。干扰对照组和干扰组的细胞增殖率分别为83.55% ± 5.14%、50.15% ± 2.12%，干扰组细胞增殖率低于干扰对照组（P＜0.01）。

2.2 各组细胞凋亡情况比较 过表达对照组和过表达组的细胞凋亡率分别为7.73% ± 0.99%、4.14% ± 0.73%，过表达组细胞凋亡率低于过表达对照组（P＜0.01）。干扰对照组和干扰组的细胞凋亡率分别为7.43% ± 0.74%、34.20% ± 3.46%，干扰组细胞凋亡率高于干扰对照组（P＜0.01）。

2.3 各组细胞迁移能力比较 过表达对照组和过表达组穿膜细胞数分别为（232 ± 16）、（393 ± 15）个，过表达组穿膜细胞数高于过表达对照组（P＜0.01）。干扰对照组和干扰组穿膜细胞数分别为（232 ± 24）、（113 ± 9）个，干扰组穿膜细胞数少于干扰对照组（P＜0.01）。

2.4 各组细胞侵袭能力比较 过表达对照组和过表达组穿膜细胞数分别为（158 ± 13）、（268 ± 18）个，过表达组穿膜细胞数高于过表达对照组（P＜0.01）。干扰对照组和干扰组穿膜细胞数分别为（155 ± 13）、（64 ± 6）个，干扰组穿膜细胞少于干扰对照组（P＜0.01）。

2.5 各组细胞m6A 表达比较 过表达对照组和过表达组细胞m6A 相对表达量分别为0.122 ± 0.004、0.240 ± 0.005，过表达组细胞m6A 表达水平高于过表达对照组（P＜0.01）。干扰对照组和干扰组细胞m6A 相对表达量分别为0.128 ± 0.005、0.072 ±0.002，干扰组细胞m6A 表达水平低于干扰对照组（P＜0.01）。

3 讨论

APL 是AML 的一种特殊亚型，其特征主要是15号与17号染色体发生易位，导致早幼粒细胞白血病基因与维甲酸受体基因融合，引起恶性血细胞克隆性增殖。近年来采用全反式维甲酸联合三氧化二砷疗法治疗APL，其治愈率已大幅度上升，但仍有部分患者出现早期死亡和复发。因此，寻找新的治疗靶点，抑制APL 细胞增殖、侵袭及迁移对改善患者预后具有重要意义。METTL14 是一种甲基转移酶，它可以催化哺乳动物的mRNA 进行m6A 修饰。表皮生长因子受体（EGFR）是METTL14 的下游靶基因，METTL14 以m6A 甲基化依赖的方式调控EGFR/PI3K/AKT 信号通路，从而抑制上皮间充质转化（EMT）和肿瘤细胞侵袭［3］。METTL14可阻断骨髓分化，促进正常造血干细胞/祖细胞和AML 细胞增殖；METTL14 介导的m6A 甲基化可提高下游靶基因MYC/MYB 的基因稳定性和翻译，而METTL14 受SP1 负调控，当SP1 表达受到抑制时，METTL14 可上调MYC/MYB 表达，从而导致骨髓分化受阻和肿瘤发生［2］。METTL14异常表达与多种肿瘤发生、增殖、转移和侵袭有关。研究显示，METTL14在结肠癌［4］、肝癌［5］、乳腺癌［6］中表达降低，并与患者的不良预后有关。MARTIN 等［7］研究发现，METTL14 在正常小鼠造血干细胞中呈低表达，在AML 小鼠造血干细胞中呈高表达；对AML 小鼠造血干细胞使用分化诱导剂后，METTL14 水平显著降低，表明降低METTL14可促进骨髓细胞分化。目前国内外关于METTL14在APL 中作用的研究较少，为了明确METTL14 与APL 的关系，我们观察了METTL14 对APL 细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调节作用。

正常细胞增殖失控是肿瘤发生的重要原因之一，APL 通过激活PI3K/AKT 信号通路，使肿瘤细胞发生恶性增殖。METTL14 对不同肿瘤细胞增殖的作用不同，表现为促进或抑制作用。HU 等［8］报道，沉默METTL14表达可显著抑制宫颈癌细胞的活力、增殖和迁移，其机制可能与METTL14 上调m6A Myc表达有关。WU 等［9］报道，沉默METTL14 表达可显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。GONG 等［10］报道，METTL14 过表达可降低m6A 水平，从而抑制乳腺癌细胞增殖和迁移。本研究结果显示，过表达组细胞增殖率高于过表达对照组，干扰组细胞增殖率低于干扰对照组，表明过表达METTL14表达可促进NB4 细胞增殖，而敲低METTL14 表达则抑制NB4 细胞增殖，METTL14具有促进NB4细胞增殖的作用。

细胞凋亡是多细胞生物体的重要自稳机制之一，对白血病的发病具有重要作用，下调Bcl-XL 等凋亡抑制基因能够改变肿瘤细胞凋亡的阈值。METTL14 对肿瘤细胞凋亡主要表现为抑制作用。QIAN 等［11］报道，在非小细胞肺癌中，沉默METTL14表达可促进细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。本研究显示，过表达组细胞凋亡率低于过表达对照组，干扰组细胞凋亡率高于干扰对照组，表明过表达METTL14 可抑制NB4 细胞凋亡，而敲低METTL14表达则促进NB4 细胞凋亡，METTL14 具有抑制NB4细胞凋亡的作用。

在APL 患者中，肿瘤细胞的迁移和侵袭是威胁患者生存的重要原因，METTL14 在多种恶性肿瘤中高表达，通过发挥原癌基因功能促进肿瘤的迁移和侵袭。WANG 等［12］报道，在胰腺癌细胞中，过表达METTL14 可抑制细胞迁移及侵袭。本研究结果显示，在细胞迁移和侵袭实验中，过表达组穿膜细胞数均高于过表达对照组，干扰组穿膜细胞数均少于干扰对照组，表明过表达METTL14可以促进NB4细胞迁移和侵袭，而敲低METTL14表达则抑制NB4细胞迁移及侵袭，METTL14 具有促进NB4 细胞迁移和侵袭的作用。

m6A 是真核生物mRNA 最主要的内部修饰，m6A 甲基化过程由甲基转移酶、功能效应子和去甲基化酶三部分动态和可逆地调节，它们分别被称为m6A 的“写入器”“读取器”和“擦除器”。m6A 参与多种生理和病理过程，m6A 水平可影响RNA 代谢，包括mRNA 降解以及修饰RNA 的加工和翻译［13］。研究表明，失调的m6A 相关蛋白和m6A 修饰在病毒感染、应激、热休克、肿瘤等疾病的发生发展中起关键作用。METTL14 是m6A 甲基化转移酶复合物的核心成分，参与m6A 修饰的动态可逆过程。m6A 修饰在白血病的发生发展中发挥重要作用［14-15］，而METTL14可以通过m6A 甲基化阻断正常骨髓分化，促进恶性骨髓的形成。WEI 等［16］研究显示，过表达METTL14 可提高卵巢癌细胞的m6A 修饰水平。本研究结果显示，过表达METTL14 促进m6A 表达，而敲低METTL14 则抑制m6A 表达，提示m6A 的修饰水平受到METTL14的调控。因此认为，METTL14可以提高NB4 细胞的m6A 修饰水平，从而促进APL 的恶性增殖。

综上所述，过表达METTL14 的NB4 细胞增殖、迁移、侵袭能力增强，凋亡能力减弱，促进NB4 细胞m6A 表达增高；而敲低METTL14 的NB4 细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱及凋亡能力增强，抑制NB4 细胞m6A 表达增高。这表明METTL14 能够调节APL细胞的生物学功能，通过提高NB4 的m6A 修饰可促进APL恶性增殖，其具体机制仍需进一步研究。