免疫指标在结核性胸腔积液诊断中的研究进展

谭慧 综述 王璞 审校

(重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科,重庆 400016)

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的结核病是威胁人类生命健康的全球公共卫生问题之一。《2021年全球结核病报告》[1]指出,2020年全球范围内估算有990万结核病新发病例,死亡约151.4万例,是当下仅次于新型冠状病毒肺炎的第二大单一传染病致死原因[2-3]。按最新的诊断分类,结核性胸腔积液(Tuberculous pleural effusion,TPE)归属于肺结核[4],发病率约占所有结核病患者3%～30%[5]。TPE是MTB抗原引起的T淋巴细胞介导的胸膜腔内渗出性迟发型超敏反应和胸膜感染共同作用的结果[6-7], MTB抗原通过胸膜下实质病灶的破裂进入胸膜腔,诱发炎症反应导致毛细血管通透性增加、胸腔积液形成;可能是MTB原发感染的一种表现,也可能与结核病再激活有关。在病变部位,活化的淋巴细胞聚集呈现“区室化”, 各种T细胞通过分泌细胞因子相互作用,形成特殊的感染灶微环境;强烈的免疫反应对MTB有效抑制及清除,故而渗出液的细菌载量少、培养阳性率低,使得从细菌学角度鉴别TPE与其他胸腔积液,尤其是恶性胸腔积液(Malignant pleural effusion,MPE)在临床上相对延迟且具有挑战性;从病理学角度,即使内科胸腔镜的安全性和有效性已得到证实,但高度依赖于操作员专业技术和精密设备,在基层医院开展受限,因有创性往往不被患者接受。近年来,国内外对于诊断TPE的生物标志物的研究众多,腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase, ADA)在TPE诊断方面的应用价值得到大众认可、已在临床实践中广泛开展。本文主要就近年来新兴的免疫指标在TPE诊断及鉴别诊断的研究进展予以综述,旨在为临床早期识别TPE以及今后相关研究提供参考。

1 免疫指标用于TPE的诊断研究进展

免疫指标按来源分为细胞因子、固有免疫、体液免疫指标,其中细胞因子主要包括干扰素、白介素、趋化因子,通过运用免疫病原微生物实验检测方法,检测TPE中上述目标免疫物质,从而达到早期临床识别TPE的目标。

1.1 细胞因子

1.1.1 干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ) 主要由活化的CD4+ T细胞和自然杀伤细胞释放,机体感染MTB后,IFN-γ能使巨噬细胞聚集且增加其对MTB的杀菌活性,控制感染播散[8];另一方面,它又能通过程序性死亡分子1(PD1)及其配体(PD-L1)通路抑制CD4+T细胞增殖及黏附活性,使MTB不易被清除[9],在发挥TPE患者中发挥杀菌作用时具有正向和反向双重作用。国内外学者肯定了非刺激性IFN-γ对TPE的诊断性能：Aggarwal等[10]一项Meta分析显示, IFN-γ诊断TPE的敏感性93%,特异性96%,PLR 22.80,NLR 0.07,随后在后续进行的另一项Meta分析中比较了IFN-γ、ADA对TPE诊断准确性,结果表明IFN-γ在确诊和排除TPE方面均优于ADA[11]。一些学者也探讨了IFN-γ和ADA的联合诊断价值,提出当在两者均为阴性,在中、高度疾病流行情况下可用于排除TPE;若均为阳性,对于微生物学未确诊的患者,可启动ATT[12]。IFN-γ是淋巴细胞来源的生物标志物,因此也受TPE不同的感染背景的影响。在TPE患病率较低时,PPV相当低;但IFN-γ在任何流行情况下的NPV均优于ADA：当TPE流行率为5%、25%和85%时,ADA的NPV分别为99.6%、97.6%和76.0%,IFN-γ的NPV分别为99.8%、98.8%和83.0%[13]。虽然IFN-γ比 ADA似乎更具优势,但从成本效益出发分析,IFN-γ检测成本高、量化技术繁琐; INF-γ超灵敏快速免疫悬浮法(IRSA-TB)比ADA似乎拥有更好的成本效益[14-15],但现阶段暂未在临床实验室广泛开展。

1.1.2 γ干扰素释放试验(Interferon-γ release assays,IGRA)通过量化MTB基因组差异区域(RD)-1编码的特定抗原[包括早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)和TB7.7(p4)]刺激离体的效应T淋巴细胞释放的IFN-γ,判断是否存在MTB特异性细胞免疫反应[16]。包括酶联免疫斑点检测法T-SPOT.TB 和酶联免疫吸附测定QuantiFERON-TB Gold(QFT), 是世界卫生组织(WHO) 批准用于潜伏性结核病诊断的两种较成熟的检测方法[17]。 QuantiFERON检测MTB特异抗原(ESAT-6、CFP-10和TB7.7)刺激产生的IFN-γ浓度;T-SPOT.TB则检测外周血中受ESAT-6和CFP-10刺激释放的IFN-γ的T细胞,对其进行斑点计数。与PPD相比,ESAT-6和CFP-10不存在于绝大部分非结核杆菌(NTM)和卡介苗(BCG)中,可避免BCG接种和NTM感染带来的假阳性[18]。T-SPOT.TB的诊断性能优于QuantiFERON[19],目前在临床实践中,应用外周血T-SOPT.TB筛查结核感染开展较为广泛,尤其是对于使用免疫抑制剂、生物制剂或小分子靶向药物的患者,在启动上述治疗方案初期,需密切随访监测A、B斑点数变化,避免在治疗期间出现继发结核感染或潜伏结核活动。由于MTB抗原特异性淋巴细胞的“区室化”特性,多项研究提出胸水T-SPOT.TB诊断效能优于外周血[20-22];但在临床实验室,T-SOPT.TB应用于胸水标本仍比外周血标本少见,可能与胸腹腔积液、脑脊液等临床样本缺乏统一的操作流程和判断标准有关。

1.1.3 白细胞介素27(Interleukin27,IL-27) 白细胞介素可与特定受体结合介导白细胞间的通讯,进而促进各种类型的炎症反应。研究发现一些白介素在TPE中升高,促使学者探索它们在诊断TPE及鉴别TPE 与其他类型胸腔积液方面的潜在价值。IL-27是一个值得关注的指标,它是一种主要由活化的抗原递呈细胞所分泌的异二聚体,属于IL-12/IL-6细胞因子家族成员,作为MTB感染人体后免疫应答中重要的细胞因子,通过Th1免疫反应参与 IFN-γ 的产生,对Th1型免疫和IFN-γ分泌存在双重调节作用[23]。许多研究均报告了胸水 IL-27对于TPE的诊断是一种敏感而特异的生物标志物：有3项Meta分析全面评估了IL-27对TPE的诊断效率,分别纳入9项(1 226例患者)、7项(1 157例患者)、11项(1 454例患者)研究,其敏感性为92%～95%、特异性为90%～92%、PLR 为13.99～29.87、NLR 为0.07～0.09[24-26]。IL-27在鉴别TPE和恶性胸膜间皮瘤、淋巴瘤所致的胸腔积液不尽如人意[27],在小儿TPE中的诊断价值亦有限,无法区分儿童TPE和肺炎支原体肺炎性胸腔积液[28]。但学者们一致认为IL-27联合IFN-γ或ADA,或者3者联合检测可提高诊断效率(当3项至少有一项为阳性时,最佳灵敏度为100%;当3项都呈阳性时,特异性为100%)[29],可作为临床诊断TPE的优选策略。另外,Jiang等[30]探讨了年龄作为独立协变量对胸水ADA、IFN-γ和IL-27在TPE诊断方面的影响,在年轻患者(≥18岁、≤40岁)中, ADA的诊断性能最优;对于40岁以上患者,IL-27和IFN-γ在区分TPE与非TPE表现更出色,故建议在临床上将生物标记物与年龄相结合,以较高的敏感性和特异性估计TPE的发生概率,可能使患者避免侵入性操作。但IL-27检测支出大、技术繁琐,如何降低检测成本、简化检测程序可作为未来研究探索的空间。

1.1.4 其他白介素 一些研究发现胸水IL-32、IL-33、IL-2、可溶性IL-2受体(sIL-2R)、IL-31在TPE中表达亦增高,对TPE诊断有潜在价值[31-35],但它们的临床相关性及诊断准确性需进一步确定,且与ADA、IFN-γ以及IL-27相比,无明显优势。

1.2 趋化因子 趋化因子CXCR3配体,由IFN-γ诱导,强烈募集免疫细胞,与结核病发病相关;包括3种趋化因子(CXCL9、CXCL10和CXCL11)。CXCL10,又名IFN-γ的诱导蛋白10(IP-10),在结核病患者的血液和体液中得到了最广泛的检测;连续的血浆IP-10检测可能有利于区分来自LTBI的活动性结核[36]。Porcel等[37]评估了胸水IP-10浓度识别TPE的灵敏度和特异性,分别为84%和90%,与IFN-γ一样,它的预测值不受年龄影响。Chung等[38]研究评价了胸水CXCL9、CXCL11对TPE的诊断价值,发现它们在TPE组浓度显著高于非TPE组(MPE、PPE、漏出液),AUC均>0.9,其中CXCL9在区分TPE与MPE中表现最佳。趋化因子在TPE诊断中的潜在作用值得关注,现阶段涉及文献较少,其适用性、稳定性、检测技术和成本,以及免疫状态是否会影响结果,这些问题需要在未来多中心研究中解答。

1.3 其他免疫学相关指标 单核-巨噬细胞对于宿主免疫MTB感染至关重要,在不同因素刺激下,可通过经典激活或替代激活途径极化为“促炎”型M1细胞(CD14+CD86+)、“抑炎”型M2细胞(CD14+CD163+)。一项前瞻性研究比较了TPE和MPE胸水M1/M2型细胞数量、占比,发现TPE中巨噬细胞向M1极化,MPE向M2极化,提出可通过胸水巨噬细胞的极化方向对两者进行辨别[39]。程序性死亡分子-1配体(PD-L1)及其可溶性形式(sPD-L1)是近年来免疫微环境研究的热点,抗PD1/PD-L1抗体已在肿瘤的靶向免疫治疗取得巨大突破。PD-1/PD-L1通路在抗结核免疫中主要发挥负性调节作用,抑制T细胞活化,从而阻止过度免疫损伤;动物试验证实敲除PD-1、PD-L1后,小鼠肺部病理变化加重,MTB负荷升高[40]。有研究提出TPE胸水中sPD-L1明显高于MPE或非TPE;对TPE的诊断有一定辅助价值(AUC>0.8)[41-42]。PD-L1为TPE的诊断研究提供了新的方向,其在TPE中的具体机制以及诊断准确性尚不明确,现阶段在肿瘤的免疫向治疗领域应用更为广泛,PD-1抗体特异性与T淋巴细胞表面的PD-1结合或PD-L1抗体与肿瘤细胞的PD-L1结合,从而解除肿瘤细胞对淋巴细胞的免疫抑制调节,达到杀灭肿瘤细胞的目的。

2 新的技术方法在TPE的诊断研究进展

随着人类基因组的解码和基因检测技术的日益成熟,高通量测序技术被广泛应用于临床医学,为研究者中在体液或胸膜组织中探索能够有效诊断TPE的新型生物标志物创造了一种新的机遇;学者们也利用高通量测序方法探讨与结核病相关的RNA、蛋白质和小分子代谢物质,涉及转录组学、蛋白质组学和代谢组学。

2.1 转录组学-miRNA 一类小型非编码RNA,不仅存在于细胞中,也存在于各种体液中,具有良好稳定性且易于检测,可通过实时荧光定量PCR技术完成胸水中miRNA的定量检测[44]。miR-29a属于较早发现的与肿瘤相关的miRNA之一,在肺结核的发病机制中也起重要作用,通过与IFN-α mRNA结合负向调节机体对MTB的免疫应答[45]。有研究发现TPE患者胸水miR-29a的表达明显高于MPE;且miR-29a与ADA在TPE中呈显著正相关;在ATT后胸腔积液中miR-29a表达下调,提示miR-29a有望成为鉴别TPE与MPE的新指标,并判定结核病的活动性[46]。但由于尚无基于大样本的研究对TPE高表达的miRNA进行筛选和验证、胸水中miRNA浓度偏低、定量检测技术待优化、对于已筛选的特异性miRNA在TPE中的作用机制仍未知等因素,目前暂未开发商业化的基于miRNA组合物的TPE预测试剂盒。

2.2 蛋白质组学 主要研究生物体内蛋白质含量动态变化,多年来一直是生命科学各个领域的研究热点。蛋白质组学在结核病研究和临床应用中具有巨大潜力。基于质谱分析的非标记定量蛋白质组学技术是近年来发现结核病相关蛋白标记的有前途的方法[47],从体液中分析出与非结核性疾病患者之间的差异性蛋白,再通过蛋白质谱的比较分析,寻找到结核性相关特异性蛋白,进而发现TPE新型诊断标志物。补体C1抑制物、铜蓝蛋白、溶菌酶前体、凝溶胶蛋白等被发现在TPE中高于MPE[48-51],显示了区分TPE与MPE的潜在能力。国内学者有两项研究对比分析了TPE患者血清、胸水蛋白质组,发现TPE患者体液中特异性高表达相对分子质量为2660的蛋白质,提示具有此特征的蛋白可能是诊断TPE的目标蛋白[52-53]。此方面研究受限于诸多因素(如蛋白质样品的制备处理、技术成本高等),仅停留在描述阶段,对初现曙光的目标蛋白也缺乏更深层次研究。

2.3 代谢组学 主要是通过探索生命体在不同生理病理状态下所产生的内源性小分子代谢物变化规律,寻找疾病的特异性代谢标志物。核磁共振(NMR)光谱和质谱(MS)是代谢分析的两种主要技术[54]。有研究对TPE、MPE患者胸水小分子的代谢谱进行了比较分析,发现它们间的物质代谢差异显著：研究在TPE与MPE间筛选出17种差异代谢物,TPE中有5种上调,亚油酸甲酯和替普瑞酮上调62倍、19倍[55]。细胞外囊泡(EV)的代谢组学分析是一个新的研究领域。EV是细胞在机体应激时以脂质双分子层结构包裹胞浆物质并分泌到细胞外的一种纳米级囊泡,其中包含DNA、RNA、蛋白质等成分,具有调节细胞通讯、血管生成、免疫调节作用。Luo等[56]从胸水EV代谢物水平探索了结核和恶性肿瘤的代谢重编程,为胸腔积液的机制提供了新的见解,发现了区分TPE和MPE的4个候选代谢物(苯丙氨酸、亮氨酸、磷脂酰胆碱和鞘磷脂)。对于延迟或漏诊的患者,代谢物组分析可能是生化、免疫检测的有益互补。但它也面临着蛋白质组学相似的困境,可重复性差,在尿液、血清或胸液中的MTB代谢标志物未确定,今后需开发更快速的检测方法及方便的EVs分离技术。

3 总结与展望

TPE诊断相关研究所涉及的免疫指标中,IGRA运用最为广泛,其中以外周血T-SPOT.TB最为显著,未刺激的IFN-γ、IL-27也是重要的检测指标,但由于检测成本高、技术复杂,不作为TPE诊断的常规选择。在临床中,对于不同标志物的优势可联合应用,使优劣势互补增强特异度和灵敏度以提高应用价值。其他具有潜在价值的标志物,实验证据尚不足且差异较大未被广泛接受。另外,不能提供培养和药物敏感性信息是免疫指标无法回避的缺陷。随着医学科学技术的不断发展,新兴的检测技术不断涌现,给疑难危重感染性疾病的诊疗注入“新力量”。转录组学、蛋白质组学、代谢组学相关研究的引入,为TPE的诊断开拓了新视野,但尚处于“萌芽期”,还有诸多问题待解决。在医疗条件较差的地区,需权衡检测技术性能与患方经济可承受性,“因地制宜”规范应用,同时紧密结合经典的结核病微生物学检查,降低患者疾病负担。