硫酸盐还原菌的生长因子分析及脱硫性能研究

周天然，狄军贞

（辽宁工程技术大学土木工程学院，辽宁阜新 123000）

酸性矿山废水（Acid mine drainage，AMD）pH低、含有高浓度的硫酸盐，如随意排放会导致其中污染物通过食物链摄入到人体，危害人类健康，如何对其进行有效处理是目前采矿业面临的难题之一〔1-2〕。以硫酸盐还原菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）处理技术为代表的微生物法作为一类非常具有潜力的含硫酸盐污水处理技术，具有高效、环保和低能耗等优点〔3〕。SRB 在自然环境中普遍存在，其能在厌氧或缺氧条件下利用有机物还原SO42-，产生硫化物，用以沉淀重金属，同时产生碱物质以提高pH〔4-6〕，因此SRB 可用于处理废水中SO42-的污染，目前也已有众多研究对利用SRB 的代谢处理废水中SO42-和重金属的技术进行了报道〔7-10〕。研究表明，影响SRB 代谢的因素较多，如温度、环境pH、S2-浓度和m（COD）/m（SO42-）等〔11-15〕。适宜SRB 生长的条件能提高SRB 的代谢活性，从而提高SRB 对含SO42-废水的处理效果。但目前对SRB 生长影响因素及脱硫性能的研究较少。基于此，本研究采用批量实验，综合分析温度、环境pH、S2-质量浓度和m（COD）/m（SO42-）这4 个影响因素对SRB 生长的影响，并探究SRB 在不同环境下的脱硫性能，为SRB 修复含SO42-废水的应用提供参考。

1 实验部分

1.1 SRB 的培养

富集SRB 的种泥取自辽宁省某尾矿周边湿润的土壤。将5 g 种泥加入到120 mL 无菌Starkey 培养基〔3〕中，置于厌氧条件下于35 ℃、150 r/min 转速的培养箱中振荡培养。其中，Starkey 培养基配方：0.5 g Na2SO4，1.0 g NH4Cl，0.5 g K2HPO4，0.1 g CaCl2·2H2O，2.0 g MgSO4·7H2O，1.2 g （NH4）2Fe（SO4）2·6H2O，0.1 g 抗坏血酸，4.0 mL 乳酸钠，1.0 g 酵母膏，1 L 蒸馏水，pH=7.0，121 ℃灭菌30 min。当液体变成黑色且有H2S 气味，说明培养液中已经富集出SRB。通过将5 mL 含有SRB的培养液接种到120 mL 无菌Starkey 培养基中进行连续培养实现细菌的大量增殖，得到含有大量SRB 的菌液，备用。

1.2 SRB 生长曲线的测定方法

将5 mL SRB 菌液接种到120 mL 无菌Starkey 培养基中，置于35 ℃、150 r/min 转速的培养箱中振荡培养，以无菌培养基作为空白对照组。每隔一段时间取适量菌液测定其OD600。实验共做3 组重复，取均值绘制SRB 生长曲线。

1.3 SRB 生长因子探究

采用批量实验探究温度、S2-浓度、环境pH、m（COD）/m（SO42-）对SRB 生长代谢的影响。

1.3.1 温度的影响

按V（SRB 菌液）∶V（培养基）=1∶24 将处于对数生长期的SRB 接种到一系列pH=7 的Starkey 培养基〔m（COD）/m（SO42-）=2〕中，并分别放置于不同温度（29、32、35、38、41 ℃）的培养箱中以150 r/min 转速振荡培养8 d。培养完毕，取适量液体，测定OD600、氧化还原电位（ORP）、pH、电导率（EC）、SO42-质量浓度，探究温度对SRB 生长代谢的影响。

1.3.2 S2-浓度的影响

将不同质量的Na2S 添加到Starkey 培养基后制备S2-质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/L 的含S2-培养基，再按V（SRB 菌液）∶V（培养基）=1∶24 接种处于对数生长期的SRB，在35 ℃、150 r/min 转速条件下培养8 d，探究S2-浓度对SRB 生长代谢的影响。

1.3.3 pH 的影响

调节无菌Starkey 培养基初始pH 分别为4、5、6、7、8，按V（SRB 菌液）∶V（培养基）=1∶24 接种处于对数生长期的SRB，通过检测35 ℃不同初始pH 条件下SRB 生长8 d 后溶液的OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率，探究pH 对SRB 生长代谢的影响。

1.3.4m（COD）/m（SO42-）的影响

调节Starkey 培养基中乳酸钠和Na2SO4的添加量，使Starkey 培养基中m（COD）/m（SO42-）分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，按V（SRB 菌液）∶V（培养基）=1∶24 接种处于对数生长期的SRB，在温度为35 ℃，pH=7 条件下培养8 d，探究m（COD）/m（SO42-）对SRB生长代谢的影响。

1.4 分析方法

依据《水质 硫酸盐的测定 铬酸钡分光光度法》（HJ/T 342—2007）测定SO42-质量浓度，依据《水质pH 值的测定 电极法》（HJ 1147—2020）测定溶液pH，采用笔式ORP 计测定氧化还原电位，采用笔式EC 计测定电导率。

2 结果与讨论

2.1 SRB 的生长曲线

实验测定的SRB 生长曲线见图1。

图1 SRB 的生长曲线Fig.1 Growth curve of SRB

由图1 可知，在培养时间为14～86 h 时，SRB 的数量显著增加，处于对数期，SRB 活性高、代谢旺盛。在培养时间为86～146 h 时，SRB 生长处于稳定期，细菌总数大，但是分裂增殖速度降低。由生长曲线可知，处于对数生长期的SRB 细菌增殖快、数量多、活性高、代谢旺盛，因此处于对数生长期的SRB 适合用于探究不同影响因素对SRB 生长的影响，分析SRB 在不同环境下的脱硫性能。

2.2 温度对SRB 生长的影响

富集SRB 的土壤性质以及采样点的环境会对SRB 的生长产生一定的影响，导致不同土壤富集的SRB 最佳生长温度不同。本研究就温度对实验SRB菌种生长的影响进行了研究，结果见图2。

图2 温度对SRB 生长的影响Fig.2 Effect of temperature on the growth of SRB

图2（a）为各温度条件下菌液的OD600及pH。OD600能间接体现培养液体系中的SRB 数量，由图2（a）可知，当温度为29、32、35、38、41 ℃时，培养完毕菌液OD600分别为0.99、1.29、1.33、0.51、0.39，表明SRB在29～41 ℃温度下均能存活，但在32、35 ℃培养时，菌液OD600较大，SRB 增殖较快，特别是温度为35 ℃时SRB 增殖最明显，说明该温度条件最适宜SRB 的生长繁殖。胡浩鸣〔16〕分离的SRB 菌株N19D-S 最佳生长温度为35 ℃，张琳琳〔17〕分离的SRB 菌株A3-21ZLL 最佳生长温度为35 ℃，与本研究结果一致。此外，29、32、35、38、41 ℃下培养后菌液pH 分别为8.42、8.55、8.78、8.09、7.64，当温度为35 ℃时pH 增加最为明显。pH 的增加主要归因于SRB 能够正常代谢SO42-、氧化有机物，该过程会生成HCO3-，有效提升菌液pH〔18〕。35 ℃下pH 提升最大，间接验证了35 ℃时SRB 的生长增殖活动最佳，代谢产碱度最大，而菌液呈弱碱性又促进了SRB 的增殖〔19〕。

图2（b）所示为温度对菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影响。由图2（b）可知，29、32、35、38、41 ℃下ORP 分别为-297、-371、-393、-128、-102 mV，35 ℃时，ORP 出现显著下降的现象。有报道称，在ORP＜-100 mV、5＜pH＜9 的含SO42-环境条件下，SRB 成为厌氧细菌中的优势菌种〔20〕。本研究中，与未接种SRB 的Starkey 培养基相比，SRB 在29～41 ℃培养时，溶液的ORP 均降低且均＜-100 mV，说明SRB 在此温度范围内活性均较好。此外，溶液的EC 稳定在2.75～2.90 mS/cm，说明不同培养温度条件下SRB 生长消耗培养液中的盐质量接近。由图2（b）还可知，29、32、35、38、41 ℃下SRB对SO42-的去除率分别为60.70%、85.60%、84.77%、46.41%、29.56%。35 ℃时，SO42-去除率最高；41 ℃时，SO42-去除率最小。通常细菌内部酶的活性受温度影响，从而影响SRB 处理SO42-的效率，因此SRB 的活性可以通过SO42-的去除率间接反映。通过比较SO42-的去除率可知，在32、35 ℃条件下SRB代谢比较旺盛，41 ℃下SRB 代谢比较慢，这是因为，当环境温度由29 ℃逐渐升高时，SRB 中的酶活性逐渐升高，增强了SRB 对SO42-的代谢活性，有助于对SO42-的去除；但当温度超过38 ℃时，构成SRB 菌的蛋白质结构的分子热能增加，引起部分氢键、范德华力等非共价键的断裂，导致SRB 菌整体活力下降〔21〕。因此，当培养温度为41 ℃时，SRB 对SO42-的去除率降低至29.56%。

综上所述，当培养环境温度为35 ℃时，SRB 的活力最强。

2.3 S2-质量浓度对SRB 生长的影响

S2-质量浓度对SRB 生长的影响见图3。

图3（a）为不同S2-浓度下菌液的OD600及pH。由图3（a）可知，当培养基中S2-的初始质量浓度分别为20、40、60、80、100 mg/L 时，接种SRB 培养8 d 后，OD600分别为0.30、0.23、0.25、0.16、0.14，OD600均较小且数值接近，表明大多数SRB 菌已经丧失了活力。另外，其整体呈现随S2-浓度增加OD600减小的趋势。有研究表明，当环境中的溶解态硫化物达到一定浓度时，SRB 的生长和代谢会受到一定抑制〔22-23〕。这可能是因为，S2-具有一定毒性，其含量的持续升高会使SRB 数量急剧下降〔24〕。当培养基中S2-的初始质量浓度为20、40、60、80、100 mg/L 时，pH 分别为7.71、7.68、7.55、7.41、7.26。与初始pH=7 相比，培养SRB 后溶液的pH 有所增加，但是增加幅度较小。特别是在初始S2-质量浓度为100 mg/L 时pH 增加最小。初始S2-质量浓度在20、40、60 mg/L 时，溶液中pH 的增加主要与SRB 代谢有关，在初始S2-浓度很小时，SRB 可以通过代谢生成碱性物质，但是代谢产物S2-的积累不仅会对SRB 代谢造成阻碍，还有可能会导致SRB 死亡。死亡后的SRB 会将胞内物质重新释放进入溶液并使体系pH 呈略微下降趋势。

图3（b）所示为S2-浓度对菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影响。当培养基中S2-的初始质量浓度为20、40、60、80、100 mg/L 时，溶液的ORP 分别为-179、-143、-109、-23、-13 mV。此时，在S2-初始质量浓度为80、100 mg/L的条件下，溶液的ORP均＞-100 mV，体系中SRB 几乎死亡，表明S2-浓度越高，SRB 菌体的死亡越严重。当培养基中S2-的初始质量浓度为20、40、60、80、100 mg/L 时，溶液的EC 分别为2.69、2.84、2.89、3.25、3.53 mS/cm，SRB 对SO42-的去除率分别为58.11%、49.74%、41.77%、21.59%、14.48%。当S2-浓度较低时，SRB 有活性，能够代谢SO42-；当S2-浓度较高时，SRB 代谢受S2-浓度抑制，甚至大量死亡，SO42-的去除速率显著降低。

综上所述，体系中S2-的含量越高，SRB 的活力越弱，过高浓度的S2-最终会引起SRB 菌体死亡。

2.4 初始pH 对SRB 生长的影响

H+浓度会对SRB 体内酶产生一定影响，从而使得SRB 菌体活动受到不同初始pH 水平的影响〔25-26〕。基于此，本研究考察了初始pH 对SRB 生长的影响，结果见图4。

图4 初始pH 对SRB 生长的影响Fig.4 Effect of initial pH on SRB growth

图4（a）所示为各初始pH 条件下菌液的OD600及pH 变化。由图4（a）可知，当初始pH 分别为4、5、6、7、8 时，OD600分别为0.41、0.72、0.99、1.33、1.45，即随着环境pH 的增加，OD600逐渐增加。当初始pH 为4时，OD600较低，pH 为7 和8 时，OD600显著增加，说明酸性条件会抑制SRB 的生长，而中性和弱碱性条件利于SRB 生长。由图4（a）还可以看出，培养后，溶液的pH 分别为7.01、7.33、7.89、8.78、9.48，均较初始pH 有所增加，这可能是由于SRB 在代谢硫酸盐的过程中氧化有机碳产生了HCO3-〔26〕。

图4（b）所示为初始pH 对菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影响。当初始pH 分别为4、5、6、7、8 时，溶液的ORP 分别为-176、-199、-309、-393、-418 mV，SRB 对SO42-的去除率分别为37.71%、55.74%、71.59%、84.77%、88.78%。在环境pH 为7 和8 的条件下，ORP 显著降低，表明中性和弱碱性环境对SRB的生长是有利的，此时SRB 的生长和其对硫酸盐的还原效果达到最佳，而酸性条件会抑制SRB 的代谢活动〔27〕。这是因为，溶液中的H+可以改变SRB 细胞的膜面电荷，进而对其吸附性能产生一定影响，此外，pH 也会对SRB 微生物体内的酶活力及稳定性产生一定的影响，进而对SO42-的代谢过程产生一定的影响。综上所述，SRB 对周围环境pH 的耐受范围为5～8，在pH 为7～8 的条件下，SRB 的活力最强。

2.5 m（COD）/m（SO42-）对SRB 生长的影响

m（COD）/m（SO42-）对SRB 生长的影响见图5。

图5 m（COD）/m（SO42-）对SRB 生长的影响Fig.5 Effect of m（COD）/m（SO42-） on SRB growth

图5（a）所示为不同m（COD）/m（SO42-）条件下菌液的OD600及pH 变化。由图5（a）可知，当培养基初始m（COD）/m（SO42-）分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 时，对应的OD600分别为0.89、1.12、1.33、0.97、0.91，即随着m（COD）/m（SO42-）的增加，OD600先增加后降低，当m（COD）/m（SO42-）=2 时OD600达最高，也就是SRB 的数目最高。研究表明，理论上0.67 g 的COD 可还原1 g 的SO42-〔27〕，然而，由于实际培养过程中SRB 和产甲烷细菌之间对基质的竞争，实际需要的m（COD）/m（SO42-）要远远高于理论m（COD）/m（SO42-）〔28〕。有研究表明，当m（COD）/m（SO42-）为1.7～2.7时SRB 和产甲烷细菌竞争最激烈，且在此范围内m（COD）/m（SO42-）较低时SRB 占主导地位〔15〕。当培养基中的初始m（COD）/m（SO42-）分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 时，pH分别为8.71、8.75、8.78、8.71、8.44，这表明，在培养基初始m（COD）/m（SO42-）=2 时，既可以促进SRB 的生长，又可以产生碱性物质。

图5（b）所示为初始m（COD）/m（SO42-）对菌液ORP、EC 及SO42-去除率的影响。当培养基中的初始m（COD）/m（SO42-）分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 时，接种SRB 培养8 d 后，ORP 分别降至-303、-358、-393、-346、-316 mV。研究表明，SRB 在代谢SO42-过程中，通过产生代谢物H2S、HS-和S2-等降低了溶液的ORP〔29〕。当培养基中的初始m（COD）/m（SO42-）分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 时，EC 分别为2.85、2.70、2.90、2.96、2.89 mS/cm，SRB 对SO42-的去除率分别为68.41%、77.56%、84.77%、75.70%、73.03%。SO42-在初始m（COD）/m（SO42-）=2.0 时的去除率最高，表明SRB 这个时候的代谢最旺盛。

综上所述，SRB生长的最佳m（COD）/m（SO42-）为2。

综合各影响因素对SRB 生长的影响，得到SRB 最佳生长条件为温度35 ℃、pH=7、m（COD）/m（SO42-）=2，此条件下采用Starkey 培养基培养处于对数期的SRB 8 d 后，溶液OD600、pH、ORP、EC 和SO42-去除率分别为1.33、8.78、-393 mV、2.90 mS/cm 和84.77%。

3 结论

SRB 适合用于处理含SO42-废水，但是处理SO42-效果受温度、环境pH、S2-质量浓度、m（COD）/m（SO42-）等因素限制。本研究采用批量实验，综合分析温度、环境pH、S2-质量浓度和m（COD）/m（SO42-）4 个影响因子对SRB 生长的影响，探究SRB 在不同环境下的脱硫性能，得到如下结论：

1）培养14～86 h 时，SRB 处于对数期，此时细菌的活性最高。此阶段的SRB 接种成活率高，适合接种到新环境中分析SRB 在不同环境下的脱硫性能。

2）通过将对数生长期的SRB按V（SRB菌液）∶V（培养基）=1∶24 接种到Starkey 培养基中，结合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指标，考察温度对SRB 生长的影响，发现在35 ℃时，SRB的活力达到了最大值，即SRB的最佳培养温度是35 ℃。

3）通过将对数生长期的SRB 接种到含不同质量浓度S2-的培养基中，结合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指标，考察S2-质量浓度对SRB 生长的影响，发现随着培养体系中S2-质量浓度的不断增加，不但会对SRB 活性产生一定的影响，还会使SRB细胞凋亡。

4）通过将对数生长期的SRB 接种到不同pH 的Starkey 培养基中，结合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指标，考察环境pH 对SRB 生长的影响，发现SRB 耐受的环境pH 为5～8，其中环境pH 为7～8 时SRB 的活力达到最佳。

5）通过将对数生长期的SRB接种到含不同m（COD）/m（SO42-）的培养基中，结合OD600、ORP、pH、EC 和SO42-去除率等指标，考察m（COD）/m（SO42-）对SRB生长的影响，发现SRB生长的最佳m（COD）/m（SO42-）为2。

6）在SRB 生长最佳条件，即温度35 ℃、pH=7、m（COD）/m（SO42-）=2 条件下，采用Starkey 培养基培养处于对数期的SRB 8 d后，溶液OD600、pH、ORP、EC 和SO42-去除率分别为1.33、8.78、-393 mV、2.90 mS/cm 和84.77%。