基于P38 MAPK/ERK 自噬通路探讨五眼果水提物对草酸钙晶体致HKC 细胞损伤的抑制作用

李雨君，曾春晖，李森华，言娇霞，杨 柯

（广西中医药大学药学院，广西中医药大学广西高校中药药理重点实验室，广西 南宁 530001）

肾结石是泌尿外科的常见疾病，肾小管损伤、草酸钙浓度过饱和晶体粘附是肾结石发生的必要条件，肾小管上皮细胞与草酸钙晶体之间的相互作用可导致细胞损伤［1］，受损的肾小管上皮细胞为草酸钙晶体的粘附与沉积提供附着点，从而促进结石的形成。尽管目前肾结石形成机制尚未完全清楚，但近年来研究表明自噬与肾结石的形成密切相关［2-3］。自噬是真核细胞本身具有的一种保护和防御机制，它可有效降解细胞内有害物质对肾小管上皮细胞的损害，维持真核细胞内环境稳态。

课题组前期研究表明五眼果体外可抑制一水合草酸钙晶体（COM） 形成［4］，其水提物体内可通过降低小鼠IL-6和TNF-α 水平，减轻小鼠炎症免疫反应引起的肾脏损伤，抑制小鼠泌尿系统草酸钙结石的发生［5］。在炎症发生的过程中常伴随自噬的产生，过度的自噬会加重肾小管上皮细胞的损伤，促进结石的形成。因此，本实验基于P38 MAPK/ERK 自噬通路探讨五眼果水提物对COM 晶体损伤肾上皮细胞的保护作用及其机制。

1 材料

1.1 细胞 人肾小管上皮细胞HKC，由广西中医药大学科学实验中心惠赠。

1.2 药物与试剂 五眼果购自桂林鼎康中药饮片有限公司，经广西中医药大学郭敏副教授鉴定为漆树科植物南酸枣Choerospondiasaxillaris（Roxb.） Burtt et Hill 的干燥果实。BCA 蛋白质试剂盒（批号16E25C46，武汉博士德生物工程有限公司）； LDH、Ca2＋检测试剂盒 （批号20210311、20210720，南京建成生物工程研究所）； LC3B、P62、pmTOR、Beclin-1 抗体 （ 批号 2755S、39749S、5536S、3738S，美国Cell Signaling Technology 公司）； mTOR、P38、ERK1/2、p-ERK1/2 抗体 （批号 10018370、10018370、00057920、00097416，美国Proteintech 公司）； p-P38 抗体（批号7gd6101，江苏亲科生物研究中心有限公司）。

1.3 仪器 TCSPS5II 激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司）； Synergy H1 酶标仪（美国BioTek 公司）； TS2 倒置显微镜成像系统（日本Nikon 公司）； DYY-6D 六一电泳仪（北京六一生物科技有限公司）； C170 二氧化碳培养箱（德国BINDER 公司）。

2 方法

2.1 五眼果水提物制备 取2 kg 药材粗粉，加入12 L 蒸馏水，浸泡30 min，加热提取2 h，过滤取滤液； 药渣加10 L蒸馏水加热提取1 h，过滤取滤液，合并2 次滤液，并浓缩得0.4 kg 浸膏，即得五眼果水提物。用含10%血清的培养基将五眼果水提物配制成1 mg/mL 母液，0.22 μm 滤膜过滤除菌备用，用时配制成所需质量浓度。

2.2 COM 晶体制备 参考文献［6-7］ 报道方法稍加改进，10 mol/L 草酸钠溶液和10 mol/L 氯化钙溶液混匀，置于4 ℃冰箱静置3 d，4 ℃、1 000 r/min 离心15 min，用超纯水反复清洗沉淀物3 次，将沉淀物置于50 ℃烘箱干燥，研磨成粉末，灭菌、密封备用。实验时用含10%血清的培养基配制成100 μg/mL COM 晶体。

2.3 细胞分组及处理 取对数生长期HKC 细胞，接种于孔板，待贴壁后将细胞分为正常组、模型组和五眼果水提物高、中、低剂量组（160、80、40 μg/mL），除正常组外其余各组用100 μg/mL COM 晶体损伤细胞，药物组同时给予相应质量浓度药物，培养24 h。

2.4 细胞LDH 活性和细胞活性检测 取对数生长期HKC细胞，以每孔5×104个的密度接种于96 孔板，按“2.3”项下方法处理24 h 后取上清液，严格按照试剂盒说明书测定LDH 活性。然后向各孔加入100 μL MTT （0.5 mg/mL）溶液，避光孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，在570 nm 波长处测定吸光度值。

2.5 细胞粘附情况及Ca2＋水平检测 取对数生长期HKC细胞，以每孔7×104个的密度接种于6 孔板，按“2.3” 项下方法处理24 h 后，于倒置显微镜下观察细胞形态和粘附晶体数量。然后用PBS 清洗细胞3 次，加入30 μL 5 mol/L盐酸，晃动6 孔板使盐酸浸润细胞，收集样品至离心管静置1 h，14 000 r/min 离心10 min，取上清液按照钙离子试剂盒说明书进行测定。

2.6 细胞自噬流检测 取对数生长期HKC 细胞，以每皿1×104个的密度接种于共聚焦培养皿，待贴壁后，吸弃上清液，加入含有腺病毒MOI 值为100 的完全培养基培养4 h后更换回完全培养基继续培养48 h。吸弃上清液，按“2.3” 项下方法处理24 h 后，于激光显微共聚焦下观察各组细胞自噬流，红绿荧光通过Merge 后出现的红色斑点为自噬溶酶体，黄色斑点为自噬体，通过不同颜色斑点的计数可判断自噬流的强弱。

2.7 自噬通路相关蛋白表达检测 取对数生长期HKC 细胞，以每孔2×105个的密度接种于6 孔板，按“2.3” 项下方法处理24 h 后，收集细胞，提取蛋白，BCA 蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。各组蛋白样本通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离，然后转移到甲醇活化的PVDF 膜上，于无蛋白的快速封闭液中室温封闭30 min，置于一抗溶液中4 ℃孵育过夜，TBST 清洗膜后，将膜置于二抗溶液中室温孵育2 h，TBST 清洗膜后，与ECL 底物试剂盒反应后，于凝胶成像仪中发光显色。使用Image Lab 6.0 软件测量目标蛋白灰度值，分析各组目的蛋白的表达量。

2.8 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，符合正态分布的数据以（±s） 表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 五眼果水提物对COM 晶体损伤HKC 细胞损伤的影响 与正常组比较，模型组细胞存活率降低（P＜0.01），细胞上清液中LDH 活性升高（P＜0.01）； 与模型组比较，五眼果水提物高、中剂量组细胞存活率升高（P＜0.05），细胞上清液中LDH 活性降低（P＜0.01），见图1。

3.2 五眼果水提物对COM 晶体损伤HKC 细胞黏附性的影响 与正常组比较，模型组大量晶体粘附在细胞表面，细胞间隙变大，有内容物流出，Ca2＋水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，五眼果水提物各剂量组上述变化明显减轻，Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），见图2～3。

图2 五眼果水提物对COM 晶体损伤细胞形态的影响（×200）

图3 五眼果水提物对COM 晶体损伤HKC 细胞Ca2＋水平的影响（±s，n＝3）

3.3 五眼果水提物对COM 晶体损伤HKC 细胞自噬流的影响 与正常组比较，模型组细胞自噬体和自噬溶酶体数量增加（P＜0.01）； 与模型组比较，五眼果水提物各剂量组细胞自噬体和自噬溶酶体数量减少（P＜0.05，P＜0.01），见图4。

图4 五眼果水提物对COM 晶体损伤HKC 细胞自噬流的影响（±s，n＝3）

3.4 五眼果水提物COM 晶体损伤HKC 细胞自噬相关通路蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组细胞p-ERK1/2/ERK1/2 和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高（P＜0.05），P62 蛋白表达和p-mTOR/mTOR 比值有降低趋势，Beclin-1 蛋白表达和p-P38/P38 比值有升高趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）； 与模型组比较，五眼果水提物高剂量组细胞p-ERK1/2/ERK1/2、LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低（P＜0.05，P＜0.01），而低剂量组细胞Beclin-1 蛋白表达降低（P＜0.05），见图5～7。

图5 五眼果水提物对受损细胞自噬相关通路蛋白表达的影响（±s，n＝3）

图6 各组细胞Beclin-1、LC3B、P62、P38 MAPK 蛋白表达

图7 各组细胞ERK1/2、mTOR 蛋白表达

4 讨论

HKC 细胞具有存活时间长、易于传代培养的特点，并且具有肾小管上皮细胞特有的结构和功能［8］，COM 晶体易与细胞表面粘附，导致肾小管上皮细胞损伤，受损灶为晶体提供有效的附着点，不断循环加重晶体对细胞的损伤，促进草酸钙肾结石的形成［1］，因此，本实验构建体外COM晶体损伤HKC 细胞模型进行研究。在正常状态下，各种组织细胞中LDH 释放量较少，LDH 释放量升高可反映细胞损伤的情况［9-10］，COM 晶体粘附在细胞表面，可通过测定Ca2＋水平评价肾小管上皮细胞损伤后晶体在细胞表面的黏附性。本实验结果表明，五眼果水提物可升高细胞存活率，降低COM 晶体与细胞的黏附性，减少LDH 释放，对COM晶体损伤的HKC 细胞具有保护作用。

正常肾脏有较高的代谢需求，损伤会加重代谢紊乱，并激活许多类型肾细胞的自噬，它是肾小管的一种损伤反应［11］。在自噬相关研究中，mRFP-GFP-LC3 腺病毒转染细胞在自噬流的检测中应用广泛。GFP 在溶酶体酸性环境中可使其绿色荧光发生猝灭，绿色荧光减弱指示自噬小体与溶酶体融合成自噬溶酶体。而mRFP 对酸性环境不敏感，在溶酶体酸性环境中不会使其红色荧光减弱。共聚焦显微镜成像后合成红绿色荧光，图片中黄色斑点为自噬体，红色斑点为自噬溶酶体，红色斑点越多标志着自噬水平增加［12］。本实验结果表明五眼果水提物可抑制自噬。

肾伤损后导致自噬相关的多种细胞信号通路激活，如AMPK、P38 MAPK、ERK 和JNK 通路［13］。P38 MAPK 通路是MAPK 信号通路里的一个重要亚型，在调控细胞自噬中发挥重要的作用，其作用机制主要通过抑制mTOR 依赖性途径，激活自噬［14］。ERK 也是MAPK 家族重要的亚型之一，包括ERK1 和ERK2。Raf/MEK/REK 信号通路在应激的情况下激活ERK，ERK 信号通路被激活后不仅可激活自噬，还可以通过上调自噬相关蛋白LC3B 和P62 来诱导自噬的发生［15-16］。近年来研究表明P38 MAPK 和ERK 信号通路与肾结石的形成有关，草酸刺激细胞可激活P38 MAPK 和ERK 信号通路，通过调节细胞自噬以迅速响应各种应激，保护肾小管上皮细胞，若过度自噬则会加剧损伤，促进结石的形成［17-19］。本实验结果表明，五眼果水提物可降低P38 MAPK、ERK1/2 磷酸化和LC3BⅡ/LC3BⅠ表达。

综上所述，五眼果水提物可通过调控P38 MAPK/ERK通路抑制自噬，降低晶体与细胞的粘附性，从而减轻草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的损伤。