北豆根配方颗粒质量评价

曹桂云，庄雪松，宁 波，林永强，王岱杰，崔伟亮，刘洪超，董晓弟，黄蒙蒙，孟兆青*

［1.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东省中医药治疗呼吸系统疾病技术创新中心，山东 济南 250103； 2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101； 3.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东 济南 250014］

北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC.的干燥根茎，功效清热解毒、祛风止痛，用于治疗咽喉肿痛、热毒泻痢、风湿痹痛［1］，主要活性物质为木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱等生物碱类成分［2］，具有良好的抗炎、抗氧化、镇痛、心血管保护活性［2-6］，其提取物已被开发成多种制剂，如北豆根片、北豆根胶囊等，并收载于2020 年版《中国药典》。

中药配方颗粒可直接冲服使用，符合现代人需求，已成为临床用药的重要形式。2021 年国家药品监督管理局颁布《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》［7］以规范配方颗粒标准制定工作，保障其用药质量与安全。虽然北豆根配方颗粒在临床上已得到广泛应用，但尚无按照上述要求进行质量标准研究的报道，不利于其质量评价。因此，本实验基于标准汤剂建立北豆根配方颗粒特征图谱及多成分含量测定方法，同时对两者化学成分进行一致性对比，以期为该制剂临床应用提供参考。

1 材料

安捷伦1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； XS105 型电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）； BSA224S-CW 型电子天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；TS8606 型冻干机（德国菲维科公司）； KDM 型可调控温电热套 （山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。木兰花碱对照品（上海鸿永生物科技有限公司，批号130015-202105，纯度≥98.0%）； 蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品（江苏永健医药科技有限公司，批号200056-190103、200470-210103，纯度95.3%、94.4%）。北豆根共15 批，具体见表1，经山东省食品药品检验研究院林永强主任药师鉴定为正品，根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》 制备标准汤剂，除去杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，得到对应批次饮片（批号与药材相同），分别取至少100 g，浸泡30 min 后煎煮2 次，武火煮沸，文火煎煮时间分别为20、15 min，加水量分别为9、7 倍，煎煮液趁热用200目筛过滤，60 ℃减压浓缩，冷冻干燥72 h，得到冻干粉（编号S1 ～S15）。北豆根配方颗粒（山东宏济堂制药集团股份有限公司，每1 g 相当于饮片5.0 g，批号 2010001、2010002、2010003，由20090011 批号饮片制备）。乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific 公司）； 三乙胺为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 HPLC 特征图谱建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性考察 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脱（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～15%A； 15 ～25 min，15% ～20% A； 25 ～45 min，20% ～60% A；45～50 min，60% A）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长290 nm； 进样量10 μL。理论塔板数按蝙蝠葛碱计，应不低于5 000。

2.1.2 供试品溶液制备 取配方颗粒或标准汤剂冻干粉适量，研细（过5 号筛），取约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50% 甲醇25 mL，称定质量，回流提取30 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 对照药材、对照品溶液制备 取北豆根对照药材0.2 g，按“2.1.2” 项下方法制备对照药材溶液。取蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 分别含两者20、35 μg 的对照品溶液（现配现用，避光保存）。

2.1.4 阴性样品溶液制备 取糊精（配方颗粒所用辅料） 适量，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 专属性试验 取配方颗粒供试品、对照药材、对照品、阴性样品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 北豆根配方颗粒专属性色谱图Fig.1 Specific chromatogram of Beidougen Formula Granules

2.1.5.2 重复性试验 取同一批样品，按“2.1.2” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以第6 个峰为参照，测得各标识峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别在0～1.50%、1.35% ～4.23%范围内，表明该方法重复性良好。

2.1.5.3 中间精密度试验 由不同分析人员在不同日期对同一批样品按“2.1.2” 项下方法制备6份供试品溶液，由2 台仪器在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得各标识峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别在0.05% ～1.64%、2.13% ～4.93%范围内，表明该方法中间精密度良好。

2.1.5.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下各精密吸取10 μL 进样测定，测得各标识峰相对保留时间、相对峰面积RSD 分别在0.05% ～2.12%、1.68% ～3.55%范围内，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5.5 耐用性试验 在“2.1.1” 项色谱条件下分别采用3 根Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序 列 号 02243106323647、02243106323664、02183031012465） 测定同一份供试品溶液，测得各标识峰相对保留时间RSD 均在1.23% ～2.48%范围内，并且不同仪器上均在0 ～3.46%范围内，不同体积流量下均在0 ～5.55% 范围内，不同柱温下均在0 ～2.17%范围内，表明该方法耐用性良好。

2.1.6 图谱生成 按“2.1.2” 项下方法制备标准汤剂、配方颗粒供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统” 进行分析，经多点校正和Mark 峰匹配后生成标准汤剂对照特征图谱（图2），共标定了7 个特征峰，与对照品比对后确定了峰1 （木兰花碱）、峰6 （蝙蝠葛苏林碱）、峰7 （蝙蝠葛碱），并以6 号峰为参照（S），计算其余特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。

图2 北豆根标准汤剂对照特征图谱Fig.2 Reference specific chromatogram of Beidougen Standard Decoctions

表2 共有峰相对保留时间和相对峰面积Tab.2 Relative retention time and relative peak areas of common peaks

2.1.7 相似度分析 3 批配方颗粒与标准汤剂的相似度均大于0.9，与相应批次饮片标准汤剂冻干粉的相似度均大于0.95，表明两者相似度较高；15 批标准汤剂与对照特征图谱的相似度均大于0.86，表明其制备工艺较稳定。

2.1.8 聚类分析 以共有峰峰面积为变量，采用SPSS 20.0 软件进行聚类分析，结果见图3。由此可知，当刻度距离为15 时聚为2 类，S2、S3、S6、S9、S13、S14 为一类，其余批次为一类； 不同省份饮片所制备的标准汤剂无明显区别，其中吉林、河北、山东产均可选用，但应制定内控标准。

图3 15 批北豆根标准汤剂聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis dendrogram of fifteen batches of Beidougen Standard Decoctions

2.2 HPLC 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性考察 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.05% 三乙胺 （B），梯度洗脱（0～5 min，5%A； 5～15 min，5% ～12%A； 15 ～25 min，12% ～45%A； 25～40 min，45% ～60%A）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长290 nm；进样量10 μL。理论塔板数按蝙蝠葛碱计，应不低于5 000。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取木兰花碱对照品10.71 mg，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.049 6 mg/mL的贮备液。分别精密称取经硅胶G 减压干燥18 h 以上的蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱对照品10.83、11.13 mg，置于10 mL 棕色量瓶中，50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（两者质量浓度分别为1.032 1、1.050 7 mg/mL）（现配现用，避光保存）。

2.2.3 供试品溶液制备 同“2.1.2” 项。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 专属性试验 取配方颗粒供试品、对照品、空白溶剂、阴性样品溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图4 各成分HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.4.2 线性关系考察 精密量取木兰花碱贮备液适量，置于10 mL 量瓶中，30%甲醇定容并稀释至25.28、50.57、101.14、252.84、505.68 μg/L；精密量取蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱贮备液适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容并稀释，其中前者质量浓度分别为 25.81、51.61、103.21、206.42、412.84 μg/L，后者质量浓度分别为26.27、52.53、105.07、210.13、420.27 μg/L，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，平行2 次。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.4.3 重复性试验 精密称取同一批配方颗粒，共6 份，按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含量RSD 分别为0.82%、1.41%、0.48%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.4 稳定性试验 按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，常温下于0、4、8、12、24、48 h在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含量RSD 分别为0.37%、0.35%、2.12%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.2.4.5 中间精密度试验 由不同分析人员在不同日期分别按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，采用不同仪器在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含量RSD 分别为1.43%、2.57%、1.16%，表明该方法中间精密度良好。

2.2.4.6 耐用性试验 按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，分别采用3 根Waters XBridge C18色谱柱 ［4.6 mm×250 mm，5 μm，序列号 （SN）02243106323647、02243106323664、02183031012465］，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含量RSD 分别为2.81%、2.34%、2.73%，表明该方法耐用性良好。

2.2.4.7 加样回收率试验 取0.1 g 配方颗粒，分别加入木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱贮备液1.85、0.93、0.64 mL，按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱平均加样回收率分别为101.05%、100.32%、99.78%，RSD 分 别 为0.81%、1.29%、1.74%。

2.2.5 出膏率、成分含量、转移率测定 先计算出膏率。再取15 批标准汤剂、3 批配方颗粒，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算成分含量。然后，取15 批北豆根饮片粉末（过3 号筛），每批约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入30% 甲醇25 mL，称定质量，加热回流提取0.5 h，放冷，30%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算转移率。结果见表4～5。

表4 北豆根标准汤剂出膏率、成分含量、转移率测定结果Tab.4 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Standard Decoctions

表5 北豆根配方颗粒出膏率、成分含量、转移率测定结果Tab.5 Results for paste rate，constituent content and transfer rate determination of Beidougen Formula Granules

3 讨论

3.1 标准汤剂制备 《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》 规定，配方颗粒研究需以标准汤剂为桥梁，后者为衡量中药配方颗粒与其相应饮片临床汤剂一致性的物质基准。本实验在上述规定基础上，收集15 批代表性北豆根药材并炮制成饮片，以出膏率及木兰花碱、蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱转移率为指标对标准汤剂制备工艺进行优化，再进行质量检验，用于制定相关质量标准。

3.2 指标成分选择 蝙蝠葛碱、蝙蝠葛苏林碱、木兰花碱是北豆根主要成分，具有抗炎、保护神经细胞、降压、抗氧化等活性，与药材功效相关［8-17］，并且蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱也是2020年版《中国药典》 北豆根药材及饮片的质量控制指标。因此，本实验以上述3 个化合物为指标，保证了测定成分的代表性和测定方法的适用性。

3.3 指标成分含量范围、转移率范围制定 文献［8］ 报道，以指标成分含量平均值加减3 倍SD（或70% ～130% 平均值） 为含量、转移率允许范围。结果，北豆根标准汤剂中木兰花碱含量平均值为31.48 mg/g，其加减3 倍SD、70% ～130%范围分别为11.97 ～51.00、22.04 ～40.93 mg/g，但前者过宽，不利于产品质量控制，故后者较合理； 北豆根配方颗粒中木兰花碱含量范围取标准汤剂按制成量折算后70% ～130% 平均值，即16.64 ～30.90 mg/g。另外，木兰花碱从饮片到标准汤剂的转移率为45.42%，其平均值加减3 倍SD 范围也过宽，故取70% ～130%。同法制定蝙蝠葛苏林碱、蝙蝠葛碱含量、转移率范围。

4 结论

目前，配方颗粒与传统汤剂的一致性问题受到了广泛关注，但仅有少数品种进行了相关研究［18-19］，主要包括（1） 大多数研究开展时间较早，采用企业标准配方颗粒进行对比，所得结论无法为现行配方颗粒质量控制及临床应用提供参考；（2） 部分实验设计的科学性较差，导致结论可信度较低，故应针对配方颗粒汤剂和传统汤剂等效问题进行深入考察。本实验以北豆根配方颗粒为研究对象，从出膏率、指标成分含量和转移率、特征图谱一致性等方面出发，与相应标准汤剂所含成分进行比较，既可为该制剂临床应用提供参考，也能为其他配方颗粒相关研究提供思路。