田蓟苷对大鼠A7R5 血管平滑肌细胞增殖、迁移、表型转化及Notch1信号通路调控的影响

李雅琪，马晓莉，赵云丽，李 静，袁 勇，王新春*

（1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002； 2.石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）是主动脉壁中膜的重要细胞成分［1］，血管损伤后，由收缩型转为合成型，即VSMCs 的表型转化，表型转化的特征体现为细胞异常增殖和迁移。VSMCs 在动脉内膜聚集是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS） 过程的基础，在AS 的发生发展过程中，VSMCs 表型转化失调，由血管中膜向内膜迁移并过度增殖［2］，分泌更多的细胞外基质和炎症因子［3］。由此可见，VSMCs 表型转化是动脉粥样硬化的关键性起始步骤。Notch 信号通路在VSMCs 分化、增殖、迁移及表型转化中是一个关键的“调节器”，经典的Notch1 信号通路通过激活下游靶基因Hes1、Hes5［4-5］，影响细胞增殖、凋亡和分化［6］。

田蓟苷是新疆特色植物香青兰DracocephalumMoldavica L.黄酮类化合物中含量最高的活性单体［7］。课题组前期研究发现，田蓟苷可调节脂质代谢，减少炎症介质生成，对AS 具有保护作用［8-10］。VSMCs 在AS 斑块形成的发展中起着至关重要的作用，而田蓟苷发挥抗AS 的作用与VSMCs表型转化之间的关系尚不清楚。因此，本研究采用氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL） 诱导刺激VSMCs 表型转化，探讨田蓟苷调控Notch1 信号通路对VSMCs 表型转化的影响，为田蓟苷抗AS 提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞 大鼠A7R5 血管平滑肌细胞，货号FH0419，购自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 药物 田蓟苷（纯度大于98%），由新疆药物研究所提供，称取5 mg 田蓟苷粉末，加入到1 mL DMEM 中，配制成5 mg/mL 母液，给药时用含10%胎牛血清的DMEM 培养基稀释到所需剂量。γ-分泌酶抑制剂DAPT （美国APExBIO 公司，批号A8200）； 氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL，广州弈源生物科技有限公司，批号YB-002）； 辛伐他汀（北京索莱宝科技有限公司，批号IS0170），临用时均用含10%胎牛血清的DMEM 培养基稀释至所需剂量。

1.3 试剂 0.1% 结晶紫水溶液、BCA 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1064、PC0020）； FBS胎牛血清（美国HyClone 公司，批号10100147）； DMEM 高糖液体培养基（美国Gibco 公司，批号11965092）； 0.25%胰酶-EDTA 消化液、ECL 超敏发光试剂盒、cDNA 反转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号25200-056、P0018A、K1622）； TRIzol 试剂 （美国Invitrogen 公司，批号15596026）； CCK-8 试剂盒（日本DojinDO 公司，批号CK04）； Transwell 聚碳酸酯膜嵌套（美国Corning 公司，批号3422）； QuantiNova SYBR Green PCR Kit （德国QIANGEN 公司，批号208054）； Hes1 兔单克隆抗体、RBPJκ 兔单克隆抗体（英国Abcam 公司，批号ab108937、ab180588）； Notch1 兔单克隆抗体 （美国Cell Signaling Technology 公司，批号3608S）； GAPDH 小鼠单克隆抗体、HRP 标记山羊抗小鼠IgG、HRP 标记山羊抗兔IgG （北京中杉金桥生物技术有限公司，批号10494-1-AP、140193、141987）。

1.4 仪器 Forma II 3110 水套式CO2培养箱、Pico-17 型微量高速离心机 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX53 型常规倒置显微镜 （日本Olympus 公司）； DW-86L100J-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔电冰箱有限公司）；M200 Pro 型多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）； VE-180 型垂直电泳及电转仪（上海天能科技有限公司）； ChemiDoc XRS＋型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）； Rotor-Gene Q型实时荧光定量-聚合酶链式反应 （PCR） 仪 （德国QIANGEN 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 将A7R5 血管平滑肌细胞接种于含10%胎牛血清、0.1% 青-链霉素的DMEM 高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，细胞生长融合时用0.25%胰酶-EDTA 消化液传代，传代后取对数生长期细胞进行实验。

2.2 造模及分组 将A7R5 细胞分为对照组（未加药物处理，用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基进行常规培养）、模型组（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，等体积含10%胎牛血清的DMEM 培养基作用24 h）、田蓟苷组（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μg/mL 田蓟苷作用24 h）、DAPT组（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μmol/L DAPT 作用24 h）、辛伐他汀组（50 μg/mL ox-LDL 作用24 h 后，10 μmol/L 辛伐他汀作用24 h）。

2.3 CCK8 法检测细胞活性 将A7R5 细胞接种到96 孔板中，按照“2.2” 项下分组进行处理，分别测定0 （细胞贴壁后不做任何处理）、24 （给予ox-LDL 造模24 h）、48 h（ox-LDL 造模24 h＋各组药物24 h） 细胞活性，每组6 个复孔。处理结束后每孔加入含10% CCK-8 试剂的无血清培养基100 μL，在37 ℃培养箱中孵育1.5 h，在450 nm 波长下测定光密度（OD） 值，细胞增殖活性与OD 值成正比。

2.4 Transwell 法检测细胞迁移数 将A7R5 细胞接种于6孔板中，按照“2.2” 项下分组进行处理，收集各组细胞于无血清培养基中，铺入Transwell 小室的上室中，将小室放入24 孔板，下室加入600 μL 含15% FBS 的培养基，培养24 h后，取出小室，弃去孔中培养液，PBS 浸洗2 次后，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇固定30 min，适当风干，0.1%结晶紫溶液染色40 min，PBS 浸洗3 次后，棉签轻轻拭去上室水分，将上室的纤维膜撕下，置于载玻片上，封于中性树胶中，盖上盖玻片晾干，于200 倍显微镜下随机选5 个视野观察细胞，拍照，计数。

2.5 RT-qPCR 法检测细胞SM22α、α-SMA、Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表达 将A7R5 细胞接种于6 孔板中，按照“2.2” 项下分组进行处理，收集各组细胞，采用TRIzol 法提取细胞总RNA，测定其浓度和纯度后，使用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，按试剂盒说明书进行扩增反应，以GAPDH为内参，结果以2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA 相对表达量。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.6 Western blot 法检测细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达 将A7R5 细胞接种于6 孔板中，按照“2.2” 项下分组进行处理，弃掉培养基，PBS 洗3 次后，向各组孔中加入150 μL 预冷的含1%PMSF 的裂解液，冰上裂解15 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清得到细胞总蛋白溶液，BCA 测定蛋白浓度。经10% SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法转膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，然后分别加入一抗Notch1 （1 ∶1 000）、RBP-Jκ （1 ∶ 1 000）、Hes-1 （1 ∶500）、GAPDH （1 ∶4 000） 4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜4次，加入HRP 标记山羊抗小鼠IgG 或抗兔IgG 二抗（1 ∶20 000） 室温孵育1 h，TBST 洗膜4 次，ECL 化学发光液法显影，通过Image J 1.6.0 软件对条带进行灰度值分析。

2.7 统计学分析 采用SPSS 26.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 田蓟苷对A7R5 细胞增殖的影响 与对照组比较，模型组细胞增殖能力增强（P＜0.01）； 与模型组比较，田蓟苷组、DAPT 组和辛伐他汀组细胞增殖能力减弱 （P＜0.01），见表2。

表2 田蓟苷对A7R5 细胞增殖的影响（±s，n＝6）

表2 田蓟苷对A7R5 细胞增殖的影响（±s，n＝6）

注： 与对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.05。

组别0 h24 h48 h对照组0.574±0.010.663±0.030.713±0.02模型组0.566±0.010.770±0.01** 0.837±0.01**田蓟苷组0.571±0.000.770±0.020.776±0.02＃＃DAPT 组0.567±0.010.763±0.020.777±0.01＃＃辛伐他汀组0.551±0.030.747±0.050.787±0.04＃＃

3.2 田蓟苷对A7R5 细胞迁移的影响 与对照组比较，模型组细胞迁移能力增强（P＜0.05）； 与模型组比较，田蓟苷组、DAPT 组和辛伐他汀组细胞迁移能力减弱（P＜0.05），见图1。

图1 田蓟苷对A7R5 细胞迁移的影响（×200，±s，n＝5）

3.3 田蓟苷对A7R5 细胞SM22α、α-SMAmRNA 表达的影响 与对照组比较，模型组细胞α-SMAmRNA 表达降低（P＜0.01），SM22αmRNA 表达呈下降趋势，但差异不显著（P＞0.05）； 与模型组比较，田蓟苷组、DAPT 组和辛伐他汀组细胞α-SMAmRNA 表达均升高 （P＜0.01），SM22αmRNA 表达呈增加趋势，但差异不显著 （P＞0.05），见表3。

表3 田蓟苷对A7R5 细胞SM22α、α-SMA mRNA 表达的影响（±s，n＝5）

表3 田蓟苷对A7R5 细胞SM22α、α-SMA mRNA 表达的影响（±s，n＝5）

注： 与对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.05。

组别SM22αα-SMA对照组1.12±0.051.09±0.08模型组1.00±0.020.50±0.06**田蓟苷组1.07±0.110.97±0.12＃＃DAPT 组1.07±0.050.90±0.19＃＃辛伐他汀组1.10±0.070.85±0.15＃＃

3.4 田蓟苷对A7R5 细胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表达的影响 与对照组比较，模型组细胞Notch1、Hes1、Hes5 和Jagged-1 mRNA 表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，田蓟苷组和DAPT 组细胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表达降低（P＜0.05，P＜0.01），辛伐他汀组Hes1、Jagged-1 mRNA 表达降低（P＜0.05，P＜0.01），Notch1、Hes5 mRNA 表达无明显变化（P＞0.05），见表4。

表4 田蓟苷对A7R5 细胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表达的影响（±s，n＝5）

表4 田蓟苷对A7R5 细胞Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 表达的影响（±s，n＝5）

注： 与对照组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.05。

组别Notch1Hes1Hes5Jagged-1对照组0.61±0.070.63±0.060.53±0.100.60±0.06模型组1.02±0.25**1.04±0.07**1.01±0.17**1.01±0.14**田蓟苷组0.64±0.17＃＃0.82±0.15＃0.59±0.04＃＃0.64±0.09＃＃DAPT 组0.61±0.03＃＃0.70±0.11＃＃0.45±0.22＃＃0.39±0.10＃＃辛伐他汀组0.89±0.170.71±0.07＃＃0.76±0.250.68±0.08＃

3.5 田蓟苷对A7R5 细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）； 与模型组比较，田蓟苷组细胞Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），DAPT 组和辛伐他汀组Hes1、RBP-Jκ蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），Notch1 蛋白表达无明显变化（P＞0.05），见图2。

图2 田蓟苷对A7R5 细胞Notch1、RBP-Jκ 和Hes1 蛋白表达的影响（±s，n＝5）

4 讨论

VSMCs 位于血管中膜上，在正常状态下，VSMCs 表现为高度分化的收缩型，增殖和迁移能力较差； 当血管受损或ox-LDL 刺激时，VSMCs 由收缩型转化为异常增殖的合成型，此过程称为表型转化。合成型的VSMCs 迁移到内膜吞噬胆固醇，导致脂质积累和泡沫细胞形成［11］，斑块稳定性下降，进一步加速AS 的发展。因此，控制VSMCs 表型转化对防治AS 具有重要意义。

本研究CCK-8 和Transwell 结果表明，田蓟苷可抑制ox-LDL 诱导的细胞异常增殖和迁移。α-SMA 和SM22α 作为收缩型VSMCs 的标志［12-13］，当细胞处于增殖、修复或病变状态时，该基因表达减少。本研究结果显示，ox-LDL 刺激使α-SMAmRNA 表达降低，表明VSMCs 向合成型转化，田蓟苷处理可上调α-SMAmRNA 表达，抑制ox-LDL 诱导的VSMCs 的表型转化。SM22αmRNA 表达无明显变化，可能是因为SM22α 表达具有时空性特点，在VSMCs 发育过程中，SM22α 的表达晚于α-SMA［14-15］； 并且平滑肌SM22α 表达的激活有从量变到质变的过程，表现出时间、剂量储积性［16-17］。以上结果表明，田蓟苷可抑制VSMCs 的异常增殖、迁移和表型转化。

Notch 信号通路由Notch 配体、受体、下游信号转导分子和核内应答过程组成，与细胞的增殖和分化密切相关［18］。其中，受体Notch1 被广泛关注，Notch1 信号通路能调控平滑肌细胞的分化［19-21］，配体Jaggde1 在平滑肌细胞成熟的过程中发挥作用［22］，Hes1 和Hes5 是下游靶基因。Notch 信号通路在生物进化过程中高度保守，组成部分的缺失会引起生理功能障碍，为了保证通路的完整性，本研究测定了包括受体Notch1、配体Jaggde1、靶基因Hes1 和Hes5 在内的通路基因。结果显示，ox-LDL 诱导A7R5 细胞表型转化后，Notch1 通路相关基因Notch1、Hes1、Hes5、Jagged-1 mRNA 和Notch1、RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达均上调，而田蓟苷处理可逆转表达的上调，且在基因水平的作用与DAPT 相当。值得注意的是，DAPT 抑制RBP-Jκ、Hes1 蛋白表达，对Notch1 蛋白的抑制作用不明显，其原因可能是由于DAPT 是γ-分泌酶抑制剂［23］，而Notch1 信号通路的转导途径是Notch1 与配体结合形成胞内域，胞内域在γ-分泌酶的作用下被裂解、释放，活化的胞内域易位到细胞核与RBP-Jκ 结合形成复合物，进而激活下游靶蛋白Hes1 和Hes5 的表达［20，24］，因此DAPT 对单独的Notch1 蛋白的抑制作用有限，而不影响对下游的RBP-Jκ、Hes-1 蛋白的抑制作用。鉴于DAPT 对Notch1 通路中胞内域的这种抑制过程，故而在蛋白表达层面测定通路蛋白Notch1，形成复合物的关键蛋白RBP-Jκ 和下游靶蛋白Hes-1。

综上所述，田蓟苷对ox-LDL 诱导的A7R5 细胞有确切的保护作用，其机制与抑制VSMCs 的异常增殖、迁移、表型转化，调控Notch1 信号通路有关。然而，对于田蓟苷在体内是否具有同样的作用机制还有待进一步的研究。