染料木素磺酸钠减轻慢性脑缺血大鼠神经细胞焦亡的研究

邢亚康，张丽梅，王恺迪，温亚娟，黎 晓，3，帅 萍

（1. 赣南医科大学基础医学院；2. 赣南医科大学第一附属医院病理科；3.赣南医科大学心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

高血压、高脂血症、糖尿病等多种因素容易引起动脉粥样硬化造成动脉狭窄，其中颈动脉是连接心脏和大脑的供血要塞，提供了大约70%以上的脑血流。当颈动脉狭窄程度逐渐加重（超过50%时），患者可出现头昏、头痛、失眠、记忆力减退等慢性脑缺血症状，甚至引发脑卒中或血管性痴呆［1］。慢性脑缺血是由不同原因引起的脑血管变窄或大脑供血不足，导致特定脑区域因血流量低于生理需求量而引起的区域性、波动性脑功能障碍，临床症状多缓慢而持久，对患者造成较大的心理和精神困扰［2］。随着老龄化社会的到来，慢性脑缺血对中老年人健康的危害已日趋严峻。据中国慢性病前瞻性研究分析显示，我国约有1/3 成年人存在不同程度的颈动脉粥样硬化斑块，临床研究统计显示，60 岁以上的老年人有2/3 出现慢性脑供血不足，80 岁以上老年人中有80%存在慢性脑供血不足症状［3］。因此，迫切需要寻找有效的干预手段来治疗慢性脑缺血。

目前，慢性脑缺血的药物治疗多以抗血小板聚集、抗凝、改善循环及脑代谢等为主，虽然疗效肯定，但常伴有不确定的不良反应。中医中药治疗慢性脑缺血以多层性、多途径、多靶点辨证施治为患者广泛接受，目前已发现治疗的有效药物达几十种，多以活血化瘀、益气通络为主，但治疗过程或药剂煎制过程也有诸多不便。有研究表明，一些植物单体分子结构明确且来源可靠，也具有良好的多靶标活性，且不良反应小或无［4-5］。研究发现，有些植物单体对慢性脑缺血的疗效甚至可与西药相媲美［6-7］。因此，进一步探究植物单体的药理作用具有广阔的应用前景。既往研究证明，大豆、咖啡豆等富含的异黄酮类多酚化合物——染料木素是一种具有广泛临床应用价值的植物雌激素单体［8］。染料木素在预防和治疗肾病、心血管疾病、骨质疏松、神经系统疾病等方面具有较好的活性［9］。然而，染料木素水溶性不强，生物利用度较低，因而限制了其应用。因此，本课题组参照索志荣等［10］的方法，在保留染料木素活性结构的同时，对其进行磺化成功赋予其强水溶性特征，合成了染料木素磺酸钠（Genistein-3′-sodium sulfonate， GSS）。结合文献报道及我们前期研究显示，GSS 具有多靶点效应［11-12］，并能够通过抑制细胞炎症发挥对缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用［13-14］，也可通过降低细胞凋亡水平保护慢性脑缺血模型大鼠大脑皮层神经元［15］，但GSS对慢性脑缺血的保护机制还远未阐明。细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方式，其产生的炎症反应与许多神经系统疾病的发生和发展有着紧密联系。核苷酸结合寡聚结构域样受体家族pyrin 结构域蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor pyrin domain containing-3，NLRP3）是一种多蛋白复合物，其激活是细胞焦亡的核心环节。在中枢神经系统炎性因子中NLRP3 数量最多且也在众多神经系统疾病中扮演重要角色。WANG S Q等［16］研究发现染料木素可激活GPER 启动细胞信号转导，抑制NLRP3 等炎症因子的释放并在缺血再灌注小鼠中发挥神经保护作用［16］。因此猜想，作为染料木素的衍生物——GSS也可能通过降低慢性脑缺血诱导的神经细胞焦亡，进而减轻大鼠脑内炎症损伤发挥脑保护作用，本研究对此进行了初步探讨。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 本研究使用SPF 级SD 雄性大鼠（8 周龄），购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物使用许可证号：SYXK（赣）20180004，动物合格证号：430727210100264331］。本研究涉及的动物实验已通过赣南医科大学医学伦理委员会审核［伦理审查文件编号：NO.2021204］。整个实验过程参照《动物保护和使用指南》执行，实验动物使用准则和福利措施符合欧盟指令（2010/63/EU）。

1.1.2 药物和试剂 染料木素磺酸钠（分子式C15H10O8SNa，分子量：372.28）纯度≥99%，由上海宸香医药科技有限公司合成。 NLRP3 抗体（ab214185）、GSDMD 抗体（ab219800）、IL-1β 抗体（ab9787）均购自Abcam 公司；Caspase-1 P20 抗体（WL03450）购自Wanleibio公司；β-actin抗体（MA5-15739）、Tubulin抗体（MA5-11732）、GAPDH抗体（MA1-16757）均购自Invitrogen 公司；山羊抗兔IgG（31460）、山羊抗鼠IgG（31430）等二抗均购自Thermo fisher 公司；PVDF 膜（ISEQ00010）购自Merck 公司；蛋白定量试剂盒（A33972）购自Thermo fisher 公司；增强化学发光试剂（GK10008）购自GLPBIO 公司； ELISA 试剂盒（RLB00）购自R＆D System 公司；逆转录试剂盒（C28025）购自Invitrogen公司；蛋白电泳转膜系统购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与给药 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（Sham）、模型组（2-VO+Vehicle）和治疗组（2-VO+GSS），采取腹腔注射给药，每天1 次，连续给药8 周，GSS 注射剂量为1 mg·kg-1，假手术组和模型组则注射等体积的生理盐水。

1.2.2 慢性脑缺血大鼠模型制备 参照 SARTI C等［17］改良后的双侧颈总动脉结扎（Bilateral carotid artery ligation， 2-VO）方法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠［0.4～0.5 mL·（100 g）-1］进行麻醉，于颈部正中线作一长约2 cm 的切口，随后逐层分离皮下结缔组织，充分暴露右侧颈三角区，用玻璃分针仔细分离右侧颈总动脉，注意避免牵拉和损伤伴行的迷走神经，用4#手术线于近心端和远心端分别对右侧颈总动脉进行2 次结扎；1 周后，采用相同方法处理左侧颈总动脉，假手术组仅暴露双侧颈总动脉但不结扎。手术全程控制室温在23～25 ℃，相对湿度保持在50%～60%，术中、术后大鼠均安置在温控垫上直至大鼠完全苏醒，置于笼中自由进食。第1 次结扎术后次日开始注射药物至腹腔，持续8周。

1.2.3 ELISA 实验方法 给药8 周，大鼠麻醉后腹腔静脉取血，注意避免溶血。于4 ℃下以1 000 ×g离心20 min，小心收集上层血清。严格按照试剂盒操作说明，进行加样、孵育、洗涤、显色等步骤操作，于450 nm 波长检测吸光度值，并对应标准曲线读出相应值进行统计分析。

1.2.4 Real time-PCR（RT-PCR）方法 在取材期间，从每只大鼠大脑皮层组织中另取10～20 mg 制成组织匀浆，全程于冰上完成。匀浆中继续加入10×Trizol，待组织充分裂解后加入1/5体积的氯仿，振荡15 s，样品静置2～3 min 后在4 ℃下以12 000 ×g 离心12 min，吸取上清至另一离心管中，再按1/2 的体积加入异丙醇，将混合液振荡后静置于-20 ℃一段时间，再次在4 ℃下12 000 ×g 离心10 min，弃掉上清液，用含有75%乙醇的DEPC 水洗涤一次，悬浮沉淀后再次4 ℃下7 500 ×g 离心5 min 弃上清，真空干燥10 min，加入约20 μL 的RNase Free 溶解RNA 沉淀，定量至500 ng·mL-1。随后进行逆转录实验和实时定量PCR 实验。qPCR 反应体系：cDNA 1 μL、2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL、All-in-OneTMqPCR Primer 2 μL（终浓度0.2 μM）、加超纯水至20 μL。PCR 反应条件：93 ℃预变性10 min，进行40 个循环，每个循环包括：93 ℃变性10 s，65 ℃退火20 s，75 ℃延伸15 s。引物序列参见表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot（WB）方法 取大脑皮层组织加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液充分裂解后，在组织匀浆机中研磨，然后4 ℃下12 000 ×g离心15 min，取上清，采用BCA 试剂盒进行蛋白定量，取20 μg总蛋白加入上样缓冲液于100 ℃金属浴中煮沸5 min，冰上放置5 min，开始SDS/PAGE 凝胶电泳实验。在冰冷环境中将胶上的蛋白电转移至PVDF 膜，转膜结束后进行封闭，封闭结束后于4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗净一抗后于室温二抗孵育1 h，最后使用化学发光成像系统显影后对条带进行灰度定量分析。

1.2.6 统计学处理 数据使用Graphpad Prism 8.0.1 软件进行分析。结果以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way Anova），2组间比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 GSS对模型组大鼠IL-1β表达的影响 ELISA检测大鼠血清中IL-1β 的含量，结果如图1A 所示，与假手术组比较，模型组大鼠外周血清中IL-1β 的含量显著升高（P=0.042 9）；与模型组比较，治疗组大鼠外周血清中IL-1β 的含量有所下降，但差异无统计学意义（P=0.073 3）。采用RT-PCR 和WB 方法检测大鼠大脑皮层组织中IL-1β 的mRNA 及蛋白表达水平，结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮层IL-1β的mRNA表达水平明显升高（P=0.025 5），蛋白表达水平也显著升高（P＜0.000 1）；与模型组比较，治疗组大鼠大脑皮层IL-1β 的mRNA 表达水平及蛋白表达水平均显著下降，且差异有统计学意义（P=0.020 0、P＜0.000 1）（图1B、图1C）。表明GSS可以通过降低大鼠脑内局部炎症水平发挥对神经细胞的保护作用。

图1 GSS降低慢性脑缺血大鼠血清、大脑皮层组织中IL-1β的表达水平

2.2 GSS 对缺血诱导细胞焦亡的影响 采用RT-PCR及WB技术进一步检测了各组大鼠大脑皮层组织中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20的mRNA及蛋白表达水平。与假手术组比较，模型组大鼠大脑皮层中NLRP3、GSDMD和Caspase-1 P20 的mRNA 水平（P=0.044 3、P=0.022 9、P＜0.000 1）及蛋白表达水平（P=0.000 3、P=0.000 7、P=0.074 1）均升高，与模型组比较，治疗组脑皮层中NLRP3、GSDMD 和Caspase-1 P20 的mRNA 水平（P=0.001 2、P=0.004 4、P=0.005 8）及蛋白表达水平（P=0.008 4、P=0.026 8、P=0.038 5）均降低（图2），提示GSS 可以有效减轻慢性脑缺血诱导的神经细胞焦亡。

图2 GSS对慢性脑缺血大鼠大脑皮层神经细胞焦亡的抑制作用

3 讨论

慢性脑缺血通常发病隐匿，容易被患者忽视，当其发展为血管性痴呆时为时已晚。因此，合理预防至关重要。研究发现，大豆及葛根等食材富含的染料木素可发挥多种植物雌激素样作用［18］，并且，染料木素已作为国家中药第1类预防和治疗绝经妇女骨质疏松症的原料药（批件号2004L01547）。但由于染料木素难溶于水，限制了其生物利用度。GSS是染料木素进行磺化改造后获取的强水溶性单体。本课题组前期研究证明，GSS 可通过激活G 蛋白耦联雌激素受体抑制神经炎症和兴奋性毒性损伤［12］，也可通过抗炎症、抗凋亡［14，18-19］等路径对缺血再灌注或慢性脑缺血大鼠发挥良好的神经保护作用。本研究结果显示，慢性脑缺血后大鼠外周血清中IL-1β 的含量和大脑皮层中IL-1β mRNA 及蛋白的表达水平均显著升高，但GSS 对外周炎症反应的抑制作用并不明显，而对大脑局部炎症的抑制作用显著。文献［20］显示，细胞焦亡与炎症反应关系密切。IL-1β 的释放依赖于细胞焦亡执行蛋白gasdermin D（GSDMD），表现为质膜破裂、细胞肿胀和染色质凝集，随后引起细胞因子和免疫因子的大量释放，引发过度的炎症和免疫反应。GSDMD 介导的细胞膜上孔洞形成引起的细胞焦亡是程序性细胞死亡的一种形式，也是一种促炎症的调节性坏死方式。先前认为，细胞焦亡主要由NLRP3 炎症小体介导，随着研究的深入发现，GSDMD 蛋白尤其是Caspase-1裂解的GSDMD 所介导的细胞膜孔形成才是细胞焦亡的关键特征［21］。另有研究［22］表明，小胶质细胞的炎性活化在缺血缺氧性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）的发生发展中扮演着关键角色。TAN L L 等［23］认为，NLRP-3/GSDMD 通路在HIBD 中参与了小胶质细胞焦亡过程并起到了重要的调控作用，该通路激活将导致小胶质细胞的炎性活化，通过减弱小胶质细胞焦亡这一过程，可减轻小胶质细胞活化分泌炎症因子而引发的周围炎症程度，从而减轻HIBD 后早期和持续的脑损伤程度。本课题组成员在脑缺血再灌注损伤大鼠模型中也发现，GSS可以通过调控小胶质细胞极化，减轻大鼠脑内炎症损伤程度［12-13］，提示GSS 可能通过减少小胶质细胞焦亡而降低大鼠脑内炎症水平发挥脑保护作用。本研究进一步观察了慢性脑缺血大鼠神经细胞的焦亡水平，结果发现，慢性脑缺血后，大鼠大脑皮层中NLRP3、GSDMD 和Caspase-1 P20 的mRNA 水平及蛋白表达水平均明显升高，经GSS 治疗后显著下调。这些结果提示GSS可能通过减轻慢性脑缺血诱导的神经细胞焦亡，降低大脑局部炎症水平，发挥脑保护作用。然而，目前还不清楚GSS通过何机制减轻慢性脑缺血诱导的神经细胞焦亡，以及尚未明确GSS是通过抑制小胶质细胞焦亡减轻炎症损伤间接保护神经元为主，还是直接抑制神经元焦亡为主而发挥对慢性脑缺血大鼠的脑保护作用，这也是我们后续拟重点探讨的内容。