“补肾填精”中药复方改善脑瘫大鼠运动发育落后的机制研究

李 烽，朱振兴，李志欣，邵银进，朱惠芳

（1. 赣州市人民医院康复医学科；2. 赣南医科大学第一附属医院儿童医学中心 儿童医学研究所，江西 赣州 341000）

脑瘫是脑部神经受损所致的持续性中枢性运动和姿势发育障碍，是引起儿童运动功能障碍的常见病因之一，也是导致儿童终身残疾的常见原因。一直以来，传统中医药在改善脑瘫预后方面具有独特的优势，其中以针灸和按摩为主要手段［1］，而中药治疗的报道相对较少，原因可能是难以对本病形成统一的辨证标准。然而，中药是把握整体以辨证施治，能标本兼顾，因此从理论上来说对脑瘫也应具有良好的治疗效果。据中医古代医籍，可将脑瘫归属于中医“五迟”“五软”的范畴。历代中医学家认为先天禀赋不足、胎元失养为脑瘫的主要病因。而肾主骨，为先天之本，作强之官，从中医辨证思维来看，脑瘫患儿的病本在肾。现代医学认为，脑瘫主要是胎儿在母体孕期宫内感染或缺氧缺血导致的神经元受损甚至死亡，是脑损伤的最直接后果［2］。其中自噬是调节神经元死亡的重要通路［3］。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是一种由催化亚基和调节亚基构成的异源二聚体复合物，同时具有胞内磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，在传导细胞内外信号、调控细胞生长、分化和凋亡中发挥重要作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B 又被称为AKT，是PI3K 下游重要的效应分子之一。当PI3K激活后，可促进AKT发生磷酸化，并进一步对下游靶蛋白进行磷酸化。其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/AKT 下游的关键靶点蛋白。mTOR 是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白质家族成员，广泛参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程，在细胞对缺氧和炎症的应激反应（如诱导细胞自噬和细胞存活）中发挥了极为重要的作用。有研究［4］表明，在脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的幼年脑瘫小鼠模型中，可通过mTOR 信号通路依赖的途径诱导炎症介质（如IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α）释放，并导致神经元损伤；而mTOR 信号通路的抑制可降低由缺氧导致的神经损伤［5］。自噬作为调节细胞内蛋白和受损细胞器降解和循环再利用的过程，在应对胞内压力（如代谢应激和氧化损伤）时维持细胞稳态、衰老、免疫及神经退行性疾病等多种生理病理过程发挥重要作用；雷帕霉素诱导的细胞自噬可通过mTOR依赖途径发挥神经保护作用［6-7］。有研究［8-9］表明，mTOR 信号通路的抑制可改善幼年小鼠脑瘫模型的神经炎症和神经元死亡。由此可见，PI3K/AKT/mTOR 信号通路介导的炎症反应和细胞自噬在脑瘫的形成过程中具有重要作用。

本研究通过腹腔注射细菌LPS联合缺氧的方法建立幼年大鼠脑瘫模型，以模拟由于宫内感染及缺氧导致的幼儿脑瘫。在模型鼠中评价“补肾填精”中药复方对大鼠脑瘫所致运动功能障碍的改善情况，并对相关的分子机制进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级性成熟的2～2.5 月龄Wistar 大鼠由赣南医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（赣）2023-0004。其中雄性大鼠10 只、雌性大鼠20 只（210～220 g）。子代大鼠由性成熟雄性和雌性大鼠按1∶2数量的性别比例合笼交配获得。所有大鼠均饲养于SPF 级动物房中。医学实验动物处理遵循实验动物管理和使用规定。

1.2 药物与试剂 “补肾益精”药方组成：熟地（6 g）、山药（6 g）、山茱萸（6 g）、太子参（6 g）、炒白术（6 g）、黄精（6 g）、远志（6 g）、节菖蒲（6 g）、龟甲（6 g）、鳖甲（6 g）、甘草（6 g）。全部药材同批次购自赣州市医药公司，由赣州市人民医院中药房制剂室制备。LPS购自美国Sigma 公司。兔抗大鼠PI3K、 mTOR、磷酸化mTOR（Ser2448）、AKT、磷酸化AKT（Ser473）、LC3、p62、GAPDH 等多克隆抗体均购自Proteintech公司。酶联免疫吸附试剂盒TNF-α、IL-1β 和IL-6购自Elabscience 公司。IL-4 和IL-10 酶联免疫吸附试剂盒购自上海江莱生物有限公司。

1.3 分组与方法

1.3.1 幼年脑瘫大鼠动物模型的建立 将生育期SPF 级Wistar 大鼠以雄性10 只、雌性20 只合笼，于每日早晨8 时对雌鼠进行阴栓检查，发现阴栓则记录为妊娠第0 d。孕鼠单独饲养，随机选取15 只作为模型组，5 只为对照组。模型组在妊娠第16 d腹腔注射LPS 450 μg·kg-1，12 h 后将孕鼠置于缺氧环境下（92%氮气+8%氧气）处理2 h［10］。对照组不做缺氧处理，腹腔注射同等剂量生理盐水。饲养环境温度为22～24 ℃，湿度为40%～50%。

1.3.2 行为学评估及模型鼠筛选 模型组孕鼠和对照组孕鼠产仔后得到幼鼠，将9 日龄的幼鼠进行运动行为学测试及评分，测试项目包括随意运动、姿势、肌力、肌张力和不自主动作。同时出现以上5 项功能异常筛选为脑瘫大鼠。从对照组孕鼠产下的子代中随机挑选获得正常幼鼠。

1.3.3 实验分组 将所得模型幼鼠随机选取20 只，分为2 组：脑瘫治疗组（A1）和脑瘫对照组（A2）；正常幼鼠随机选取20 只，分为2 组：正常治疗组（B1）和正常对照组（B2）。另取10 只正常幼鼠不做任何处理，作为空白对照组（C）。

1.4 药物干预及效果评价 根据中药剂的临床用量，结合人体与大鼠体表面积的比例，折算出大鼠的等效给药剂量，按1 g·（25 mL）-1ddH2O 的质量体积比配制免煎颗粒药。通过灌胃给予脑瘫治疗组和正常治疗组“补肾填精”中药复方水剂，给药剂量为5 mL·kg-1。脑瘫对照组和正常对照组灌服等剂量生理盐水。每日1 次，连续灌服15 d。分别于给药后第5 d、第10 d 和第15 d 对大鼠运动能力（包括悬吊试验和斜坡试验）进行测定。

1.5 ELISA 检测 动物试验结束后，大鼠眼眶采血，于37 ℃静止放置1 h 后取上层血清进行ELISA试验。整个操作过程严格按照试剂盒的操作说明进行［11］，采用双抗夹心的方法分别检测外周血中促炎因子和抗炎因子的表达水平。

1.6 免疫印迹 大脑组织预冷PBS 冲洗，眼科剪剪碎，加入RIPA 裂解液，经超声裂解后提取蛋白，BCA 法测蛋白浓度，上样，电泳1.5 h，转膜1 h，室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST 洗膜，二抗孵育1 h，PBST洗膜，采用化学发光法显影曝光。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，不同时间点的测量值采用重复测量方差分析方法进行处理，组间比较若存在统计学意义再采用LSD 检验进行比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脑瘫模型大鼠的建模与筛选 腹腔注射细菌脂多糖LPS 并对孕鼠作做一步的缺氧处理，模拟孕鼠宫内感染合并宫内缺氧的情况（图1），建立脑瘫幼鼠模型。观察各组孕鼠处理后的活动及进食情况，均基本正常。分娩情况为：模型组孕鼠（15 只）分娩时间为20～21 d，娩出存活乳鼠50 只，外观青紫，状态较萎靡，平均体重（6.68±0.48） g，次日死亡6只，剩余44只；对照组孕鼠5只分娩时间为21～22 d，娩出乳鼠36只，外观皮肤粉红色，可正常吮乳，平均体重为（7.56±0.62） g。待幼鼠达到9 日龄，进行神经行为学检测，主要包括随意运动、姿势、肌力、肌张力和不自主动作的评估。以正常幼鼠建立筛选标准（表1）。对各项行为学进行正态检验，均符合正态分布，以单侧95%CI界定为正常值，＞-x+1.96×S或＜-x-1.96×S为异常，以此为标准筛选出脑瘫模型幼鼠。对模型组44 只9 日龄幼鼠进行以上5个行为学项目的测试，得到脑瘫幼鼠42只。

表1 脑瘫大鼠模型筛选标准±s

表1 脑瘫大鼠模型筛选标准±s

筛选标准随意运动/s姿势/分肌力/s肌张力/分不自主动作/分正常幼鼠3.26±0.18 4.00±0.00 118.46±16.36 0.00±0.00 0.00±0.00脑瘫幼鼠＞3.86＜4.00＜68.82＞0.00＞0.00

图1 脑瘫模型幼鼠建模示意图

2.2 “补肾填精”中药复方改善脑瘫大鼠的运动功能 悬吊试验结果显示，与空白对照组相比，脑瘫对照组的悬吊时间明显缩短（P＜0.001）；与脑瘫对照组相比，脑瘫治疗组悬吊时间明显延长（P＜0.001），说明“补肾填精”中药复方能有效增强脑瘫大鼠的上肢力量。而正常治疗组与正常对照组相比，悬吊时间差异无统计学意义（P=0.064）（表2），说明药物的处理对于正常的大鼠不会带来明显的运动功能影响。

表2 大鼠各个时间点悬吊试验结果比较/s±s

表2 大鼠各个时间点悬吊试验结果比较/s±s

注：A1：脑瘫治疗组；A2：脑瘫对照组；B1：正常治疗组；B2：正常对照组；C：空白对照组。A1与A2比较，①P＜0.001；A2与C比较，②P＜0.001。

组别A1 A2 B1 B2 C FP n 10 10 10 10 10 F组间=3 701.45，F时间=437.55，F组间×时间=28.26 P组间＜0.001，P时间＜0.001，P组间×时间＜0.001时间点第5 d 24.64±2.84①8.65±2.61②56.86±7.48 52.68±11.64 58.40±8.96第10 d 32.83±3.41①9.61±1.48②60.32±6.65 64.62±8.48 66.57±10.21第15 d 44.73±4.72①9.21±0.86②68.46±4.92 70.78±8.41 74.40±5.83

斜坡实验结果显示，与空白对照组相比，脑瘫对照组转头时间明显延长，差异有统计学意义（P＜0.001）；与脑瘫对照组相比，脑瘫治疗组转头时间明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.001），说明该复方能显著改善脑瘫大鼠的运动功能。而正常治疗组与正常对照组相比，转头时间差异无统计学意义（P=0.863）（表3），说明药物的处理对于正常的大鼠不会带来明显的运动功能影响。

表3 大鼠各个时间点斜坡试验结果比较/s±s

表3 大鼠各个时间点斜坡试验结果比较/s±s

注：A1：脑瘫治疗组；A2：脑瘫对照组；B1：正常治疗组；B2：正常对照组；C：空白对照组。A1与A2比较，①P＜0.001；A2与C比较，②P＜0.001。

组别A1 A2 B1 B2 C FP n 10 10 10 10 10 F组间=77.27，F时间=43.73，F组间×时间=31.18 P组间＜0.001，P时间＜0.001，P组间×时间＜0.001时间点第5 d 6.58±1.22①14.42±1.28②3.11±0.72 3.32±0.54 3.21±0.63第10 d 5.36±0.74①16.43±2.66②2.93±0.48 3.02±0.43 2.8±0.32第15 d 4.42±0.32①15.82±1.69②2.43±0.52 2.85±0.67 2.14±0.54

2.3 “补肾填精”中药复方对大鼠体重的影响 为进一步评价“补肾填精”中药复方在动物体内的安全性，对各组大鼠的体重进行监测，正常治疗组与空白对照组及正常对照组相比，体重无明显差异（P＞0.05），说明了药物的安全性。脑瘫治疗组与空白对照组相比，体重明显减轻（P＜0.001），与脑瘫对照组相比体重明显增加（P=0.031）（图2），说明该中药复方能改善大鼠的整体机能，促进生长发育。

图2 大鼠体重曲线图

2.4 “补肾填精”中药复方抑制炎症反应 与脑瘫对照组相比，脑瘫治疗组外周血中促炎因子TNF-α和IL-1β 显著下降（P＜0.001），但对IL-6 的水平影响不大（P＞0.05），而抗炎因子IL-4 和IL-10 显著升高（P＜0.001）（图3）。说明“补肾填精”中药复方能改善脑瘫大鼠炎症反应。

图3 “补肾填精”中药复方对脑瘫大鼠炎症因子的影响

2.5 “补肾填精”中药复方抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的神经细胞自噬 通过WB方法检测各组大鼠神经组织中PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白表达水平发现，与脑瘫对照组相比，脑瘫治疗组PI3K 表达增加，磷酸化AKT 和mTOR 表达增加，LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值降低，自噬相关蛋白p62 表达增加（P＜0.01）（图4），说明“补肾填精”中药复方能激活脑瘫大鼠中PI3K/AKT/mTOR 信号通路，并抑制神经细胞发生自噬。

3 讨论

脑瘫是导致儿童终身残疾的最常见原因。根据流行病学调查结果发现，大约每500 名新生儿中约有1 名受脑瘫的影响［12］，近年来发病率呈逐年上升的趋势，给社会和家庭带来沉重的负担。早期发现并干预是公认的提高脑瘫救治率的关键环节。目前西医学治疗措施主要是针对性的功能训练［13］。在国内，以针灸和推拿为代表的中医治疗策略在脑瘫的治疗中取得了显著成效。研究发现，超低频经颅磁刺激结合针刺治疗可有效改善患儿的粗大和精细运动，且小儿推拿在改善痉挛性脑瘫患儿的肌力、肌张力、粗大和精细运动，肢体运动能力等方面具有较为显著的疗效［14-15］。相对于针灸和推拿的局部干预，中药治疗从整体出发，辨证施治、标本兼顾，具有其独特的优势。但关于中药用于治疗脑瘫患儿的报道相对较少，根据一项关于“中药治疗小儿脑性瘫痪”的文献归纳总结研究发现，用于治疗脑瘫患儿明确有效的方剂主要包括六味地黄汤、四君子汤、补阳活血汤、补肾地黄汤、地黄饮子、加味六黄汤以及其他自拟方剂［16］。其中涉及的疗法包括中药熏蒸［17］、中药水疗［18］、中药内服、中药蜡疗［19］、中药内服联合药浴、中药穴位贴敷以及中药熏炙，其中中药熏蒸的使用频率最高，内服的相对较少。

“补肾填精”中药复方选自曹霞等［20］的《贾六金辨治五迟五软经验总结》，该文总结了此方在脑瘫患儿中的疗效，然而病例数有限，未能形成系统的临床研究。经查阅国内外文献发现，不管是临床研究还是动物实验，均未查阅到关于“补肾填精”中药复方治疗脑瘫儿的报道。然而在其他疾病中，“补肾填精”中药复方在临床上应用广泛，涵盖了中医辨证中“肾精亏虚”的多数疾病，如卵巢早衰、卵泡发育不良、男性少弱精子、子宫内膜薄等症［21-22］；此外，对神经系统疾病，如阿尔茨海默病、抑郁症也有一定的临床效果［23-24］。据查阅中医古代医籍，未见关于“脑瘫”的记载，但将病症的描述与现代医学进行比较，脑瘫可与中医的“五迟”“五软”相对应。从中医辨证思维来看，脑瘫患儿的病本在肾，因此通过采用传统中医药的“补肾填精”思路，通过建立脑瘫幼年大鼠模型，评价“补肾地黄丸合归脾汤加减”疗法在体内对脑瘫大鼠神经运动能力的治疗作用具有一定的实践依据。

本研究中采用的“补肾填精”中药复方，熟地、山药、山茱萸三药相配，“三补”为君药，补益肾中气血阴阳；太子参、炒白术健脾补虚，滋化脾胃；黄精补气养阴、健脾、润肺、益肾之功，使五脏调和、肌肉充盛、骨髓坚强；远志、石菖蒲具有化痰开窍、健脑益智之功；龟甲、鳖甲常相须为用，龟甲具有滋阴潜阳、益肾健骨、养血补心之功；甘草调和诸药。从中医药理论上来说，本药方可对症于脑瘫的“五迟”“五软”，能够阴阳调和、强健体格、健脑益气。本研究结果也证实了“补肾填精”中药复方能有效增强脑瘫大鼠的上肢力量和显著缩短脑瘫大鼠的反应时间，整体上改善脑瘫大鼠的运动能力，具有一定的临床研究价值。

研究发现，神经细胞的死亡与脑瘫密切相关，其中mTOR信号通路被证实与脑瘫的发生相关［8，25］。本研究结果发现，与对照组相比，“补肾填精”中药复方能显著促进脑瘫大鼠PI3K的表达，并增强磷酸化AKT 和mTOR 的水平，促进下游AKT/mTOR 信号通路的激活；且明显下调自噬相关微管关联蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值，促进自噬相关蛋白p62 的表达，抑制自噬的发生。说明“补肾填精”中药复方激活了脑瘫大鼠神经元PI3K/AKT/mTOR 信号通路，并由此抑制神经细胞自噬，这可能是该中药复方改善脑瘫大鼠的运动能力的机制之一。在后续的研究中，需要对“补肾填精”中药复方相关的分子机制进行更深入地证实。在临床上也可开展相应的临床治疗试验，真实评价该复方在临床上改善脑瘫患儿运动能力的疗效。