肝细胞癌双硫死亡相关LncRNA预后模型的构建和验证

方 霞，孙江云，袁丰华

（1. 赣南医科大学基础医学院；2. 赣南医科大学第一临床医学院，江西 赣州 341000）

肝癌是全球范围内常见的癌症，具有快速生长、易发生远处转移及高死亡率等特点，主要的病理类型为肝细胞癌［1］。目前，肝癌最主要的治疗策略仍然是根治性切除［2］。由于肝细胞癌发病隐匿且进展迅速，多数患者在诊断时已为晚期，导致治疗难度增加，且治疗效果差［3］。尽管存在一些治疗方法，如经导管动脉化疗栓塞、射频热消融和靶向药物（如索拉非尼），用于治疗晚期且无法进行手术切除的肝细胞癌患者，但这些方法疗效较差［4］。因此，迫切需要在现有治疗方法的基础上寻找更有效的治疗靶点或方法，以提高肝细胞癌治疗的疗效并改善患者预后。

调节性细胞死亡是一种经过精确调控的正常细胞死亡过程，在维持组织稳态、免疫调节、抑制肿瘤发展中起重要作用［5-6］。然而，当细胞死亡调控失衡或异常时，可能会导致肿瘤形成。肿瘤细胞通过突变或异常表达凋亡调控因子（如p53）逃避细胞凋亡的触发，导致肿瘤细胞无限增殖［7］。双硫死亡是一种新发现的涉及多种代谢途径的细胞死亡方式，它与已知的铁死亡和铜死亡不同，是溶质载体家族7成员11（Solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）高表达的肿瘤细胞在葡萄糖饥饿环境下，细胞内的二硫化物含量异常增加，导致肌动蛋白细胞骨架中二硫键含量增加，进而引发肌动蛋白丝过度收缩，最终破坏细胞骨架结构并导致肿瘤细胞死亡的过程［8］。这种细胞死亡方式可能会成为靶向抑制肿瘤的新方法。

长链非编码RNA（Long noncoding RNAs，LncRNA）是指核苷酸分子大于200的RNA，不具备编码功能，参与细胞的生长、分化、凋亡等生理和病理过程［9］。LncRNA 在肿瘤发生发展中也起着至关重要的作用。研究表明，LncRNA 在肝细胞癌中异常表达，通过与其他蛋白质或RNA 相互作用，影响肿瘤细胞增殖和死亡［10］。例如LncRNA HEPPAL 通过降低SLC7A11 表达促进肝细胞癌的铁死亡［11］。目前，双硫死亡相关的LncRNA 在肝细胞癌中的作用研究较少。本文利用生物信息学技术筛选与HCC 预后有关的双硫死亡LncRNA，构建风险预后模型，并验证该模型的可行性，为寻找与双硫死亡相关的生物学靶点以及进一步研究双硫死亡相关LncRNA 在HCC中的生物学作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 数据获取和处理 从癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）数据库（https：//portal.gdc. cancer. gov/）获取肝细胞癌数据集的RNA-seq和相关临床信息数据，包括50 例正常样本和374 例肿瘤样本，提取HCC 的mRNA 和LncRNA 的表达数据，从相关文献中得到10 个双硫死亡相关基因包括：GYS1、NDUFS1、OXSM、LRPPRC、NDUFA11、NUBPL、NCKAP1、RPN1、SLC3A2、SLC7A11［8，12-13］，提取双硫死亡基因的表达量，使用Limma 包进行共表达分析，筛选标准为Pearson 相关性系数|cor|＞0.4和P＜0.001。

1.2 构建并验证HCC 双硫死亡相关LncRNA 的预后模型 对TCGA 肝细胞癌数据集中的生存数据进行筛选，保留HCC 患者的年龄、性别、生存时间、生存状态、肿瘤分级、分期，去除生存状态和生存时间未知的样本，并将表达数据与生存数据进行整合。使用Caret 包将HCC 数据按1∶1 随机分为训练集和验证集，在训练集中进行单因素Cox 回归分析（P＜0.05），Glmnet 包［14］进行LASSO 回归分析，用多因素Cox回归构建模型。计算每个患者的风险值公式为：score=∑i=1n Coef i*xi，其中xi和Coef i分别代表每个样品的LncRNA 表达量和风险系数。根据训练集中风险值的中位数将OS 患者分成高、低风险组，并在验证集和整个数据集中进行内部验证，使用survminer 包［15］绘制生存曲线、受试者工作特征（ROC）曲线和C 指数（C-index）评估模型的可行性，scatterplot3d 包进行主成分分析（PCA），评估分组的效果。运用单因素和多因素Cox回归评估风险评分是否为独立预后因素。

1.3 高、低风险组基因的功能富集分析 使用clusterProfiler 包［16］对高、低风险组差异基因进行GO和KEGG 富集分析，并对高、低风险组的基因进行GSEA 功能富集分析，探究这些基因在HCC 中参与的生物学功能，过滤条件为P＜0.05。

1.4 高、低风险组基因的免疫细胞功能及免疫治疗效果分析 使用GSVA 和GSEABase 包计算不同风险组之间免疫功能的差异，并从癌症免疫图谱（TCIA）数据库（https：//tcia. at/home）获得免疫治疗评分数据，评估高、低风险组免疫治疗效果。

2 结果

2.1 构建HCC 双硫死亡相关LncRNA 的预后模型 提取TCGA 肝细胞癌RNA-Seq 数据中mRNA 和LncRNA，得到13 162 个LncRNA，利用Pearson 相关性分析13 162 个LncRNA 和10 个双硫死亡相关基因，得到320 个双硫死亡相关的LncRNA，未发现与OXSM相关的LncRNA（图1A）。随后，利用双硫死亡LncRNA 构建预后模型，使用Caret 包将TCGA 肝细胞癌患者样本划分为训练集和验证集，对训练集进行单因素Cox 回归分析（P＜0.05）得到了40 个与HCC 预后相关的双硫死亡LncRNA（图1B），使用LASSO 回归和多因素Cox 回归分析进一步筛选，最终得到6 个双硫死亡相关LncRNA（ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1）（图1C、图1D）。

图1 HCC双硫死亡相关LncRNA的预后模型

2.2 评估HCC 双硫死亡相关LncRNA 的预后模型效果 使用Kaplan-Meier（K-M）生存曲线分析高、低风险组的预后情况，结果显示，在整个数据集、训练集和验证集中，总体生存期（Overall survival，OS）差异均有统计学意义（P＜0.05），高风险组的总生存期比低风险组的总生存期短（图2A、图2B、图2C）。此外，对高、低风险组进行风险评估，风险评分分布图（图2D、图2E、图2F）和生存状态散点图（图2G、图2H、图2I）显示，随着风险评分增加的患者死亡逐渐增加。 风险热图结果表明，ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR 在高风险组中高表达，而AL161645.1 和AC069307.1 在高风险组中低表达（图2J、图2K、图2L）。

单变量和多变量Cox 回归分析评估模型的临床意义，结果显示，风险评分和肿瘤分期是临床独立预后因素（P＜0.05）（图3A、图3B）。ROC 曲线结果显示，风险评分在AUC 值上明显优于其他临床特征（图3C）。在1 年、3 年和5 年的时间点上，风险评分的ROC 曲线下面积分别为0.745、0.709 和0.735（图3D）。相比其他临床因素，风险评分的C 指数值更高（图3E）。此外，通过主成分分析结果表明，风险模型中LncRNA 双硫死亡基因的表达具有更分散的分布特征（图3F、图3G、图3H、图3I），说明该模型中将患者分为高风险组和低风险组质量较好。

图3 评估HCC双硫死亡相关LncRNA预后模型临床效果

2.3 高、低风险组基因的功能富集分析 对高、低风险组差异基因进行GO 和KEGG 富集分析，GO 富集分析显示，生物学过程主要富集在外部封装结构组织，细胞组分主要富集在含胶原的细胞外基质，分子功能主要富集在细胞外基质成分（图4A），KEGG 主要富集在PI3K/AKT 信号通路（图4B）。此外，对高、低风险组差异表达基因进行功能富集分析，发现高风险组主要富集在细胞外基质受体途径（图4C），而低风险组主要富集在药物代谢细胞色素p450途径（图4D）。

2.4 高、低风险组基因的免疫细胞功能分析 通过GSEABase 包分析高、低风险组免疫功能之间的差异，结果显示，高风险组抗原呈递细胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趋化因子受体（CCR）、主要组织相容性复合体Ⅰ类呈递（MHC_class_Ⅰ）、副炎症（Parainflammation）和辅助性T细胞2（Th2）的表达高于低风险组（图5），高风险组的TIDE 评分高于低风险组（图6）。

图5 基因免疫细胞功能分析

图6 TIDE评分比较

3 讨论

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，具有快速生长、易发生远处转移及高死亡率等特点，严重威胁患者生命健康［17］，虽然很多学者不断研究新的治疗策略及药物靶点，但因为晚期肝癌的治疗限制性以及对靶向药物的耐药性，治疗效果差，患者生存率较低。因此，研究肝细胞癌的发生发展机制及寻找HCC有效的治疗靶点对于改善患者预后至关重要。

LncRNA 是一类核苷酸分子长度大于200 的非编码RNA，参与调控多种细胞生物学过程，包括细胞增殖、凋亡及转录后水平的分化等［18］。在细胞增殖过程中，LncRNA 可以调节与细胞周期相关的基因表达，影响细胞的增殖能力；在细胞凋亡过程中，通过调节与凋亡相关基因家族（如Bcl-2 家族）的表达，可改变细胞对凋亡的敏感性；在转录后水平的分化过程中，LncRNA 还可通过影响mRNA 的剪切和修饰影响基因表达，进而影响其生物学功能［19］。

目前已有多项研究证明，LncRNA 参与调节肿瘤代谢及细胞信号通路影响多种肿瘤的发生发展［20-21］。LncRNA 在肝癌中表达异常，促进肝癌的恶性增殖及血管生成，且与细胞的铁死亡及铜死亡密切相关［22-23］。双硫死亡是一种与糖代谢、线粒体呼吸及能量代谢等多个代谢途径相关的细胞死亡方式。有研究［24］表明，LRPPRC（Leucine-Rich alpha-2-Glycoprotein-1）作为一种参与双硫死亡的基因，能通过调控能量代谢途径影响线粒体自噬。LncRNASNHG17与LRPPRC相互作用，增强c-Myc 蛋白的表达，从而促进肝细胞癌的发展［25］。然而双硫死亡相关LncRNA 在HCC 中作用研究尚少，具体作用机制尚不清楚。通过查阅文献及应用共表达分析得到双硫死亡相关LncRNA，并利用单因素Cox回归、lasso回归和多因素Cox 回归构建了6 个双硫死亡相关LncRNA 预后模型，包括ELFN1-AS1、AL049840.2、MKLN1-AS、CYTOR、AL161645.1 和AC069307.1。已有研究［26-27］表明，ELFN1-AS1 可促进结肠癌及视网膜细胞瘤的恶性进展。MKLN1-AS 在HCC 中高表达且与患者不良预后相关［28］，与本研究结果一致。CYTOR 可通过调节miR-125b-5p/KIAA1522 轴影响肝癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡［29］。其中AL049840.2、AL161645.1 和AC069307.1 的作用尚未有研究报道。

随后，为了验证该模型的可行性，应用K-M 生存曲线分析得知模型中的高风险组总生存率低于低风险组，在1 年、3 年和5 年的风险评分的ROC 曲线下面积分别为0.745、0.709和0.735，这些值均大于0.65，表明该风险评分具有较高的预测准确性，主成分分析及C指数分析也证明该模型具有良好的预测价值。高风险组功能富集分析结果表明，双硫死亡相关LncRNA 功能主要富集在与细胞外基质受体途径有关，此途径已证实在肿瘤细胞生长、侵袭、转移和血管生成过程中起重要作用［30］。

在免疫功能方面，通过免疫功能差异分析发现高风险组中抗原呈递细胞共刺激（APC_CO_stimulation）、趋化因子受体（CCR）、主要组织相容性复合体Ⅰ类呈递（MHC_class_Ⅰ）、副炎症和辅助性T细胞2（Th2）高表达，表明双硫死亡相关LncRNA 可影响肿瘤免疫功能。并且，高风险组的TIDE 高于低风险组，表明高风险组免疫逃逸潜能大于低风险组，免疫治疗效果更差。

双硫死亡是一种新的细胞死亡方式，可能成为靶向治疗肿瘤的新方法。LncRNA 通过多种形式影响肿瘤的发生发展。本文基于TCGA 数据库构建的双硫死亡相关LncRNA 预后模型具有良好预测性能，为HCC的临床治疗和研究提供新思路。