颗粒蛋白前体在博来霉素致肺纤维化小鼠中的表达

刘洁婷，张 蕾，赵 洁，谢 甜

（海南医学院附属海南医院，海南省人民医院，呼吸与危重症医学科，海南 海口 570311）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以干咳、进行性气促为临床表现，影像学表现为寻常型间质性肺炎，其病因不明，发病机制十分复杂，除肺移植以外目前尚无特效药物，［1］。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）在肺部纤维化和结构重塑过程中发挥重要的作用［2］。颗粒体蛋白前体（progranulin， PGRN）是与炎症、肿瘤等多种疾病和生长发育过程相关的多效生长因子，可竞争性结合TNF-α 阻断其与受体结合，从而抑制由TNF-α 介 导 的 多 种 炎 症 通 路［3］。现 有 研 究 揭 示PGRN 可能是导致各种呼吸系统疾病的因素之一，且与多个器官或组织的纤维化相关。PGRN 在肺纤维化动物模型中的研究鲜有报道，本研究采用气管内滴注博来霉素建立小鼠肺纤维化模型，并观察PGRN 在肺纤维化小鼠肺部的变化，探索PGRN 在肺纤维化过程中的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

博来霉素购自海正辉瑞制药有限公司，批准文号 ：国 药 准 字 H20055883，执 行 标 准 ：YBH15562005，每瓶含博来霉素1.5 万单位（15 mg/瓶）。小鼠PGRN 抗体购自R＆D 公司。Masson染色和苏木素伊红（HE）染色所使用的试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 动物模型建立

从海南省实验动物中心购买并寄养36 只6～8周 龄，体 重 约20～25 g 的SPF 级 雄 性C57BL/6 小鼠，采用随机数字表法将所有动物随机分为生理盐水对照组（Sham 组）、博来霉素14 d 组（BLM14 d组）、博来霉素28 d 组（BLM28 d 组），每组12 只小鼠。各组动物分笼饲养，饲养温度18～24 ℃，湿度50%～60%，光暗周期交替，动物均自由饮水、摄食。整体实验均遵守美国国立卫生研究院所制定的《实验动物使用指南》。

小鼠称量体重，使用1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）经腹腔内注射充分麻醉后固定于操作台，剃除小鼠颈部毛发，博来霉素组小鼠经由颈部中部切开，钝性分离各层肌肉和筋膜，并充分暴露气管，注射器斜45°穿刺进入气管软骨环间隙，迅速向气道内注入溶解于生理盐水的博来霉素溶液（5 mg/kg）0.1 mL。Sham 组操作过程同上，仅使用等量生理盐水替代博来霉素。注射结束后直立并匀速地旋转小鼠，全层缝合创面，再次消毒切口，小鼠清醒后继续饲养。BLM 14 d 组、BLM 28 d 组小鼠分别于气道内给药后第14 天、第28 天用戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉后放血处死，摘取完整右肺组织进行病理学检查，摘取左肺组织冻存于-80°C 冰箱中备用。

1.3 组织学检查

将10%甲醛缓慢注入新鲜肺组织至充盈涨大，将肺组织快速置于10%甲醛固定至24 h。石蜡包埋肺组织制成切片，分别按步骤进行HE 染色和Masson 染色。

1.4 PGRN 免疫组织化学染色

切片充分水化，以PBS 洗涤3 次，每次3 min，置于96～98℃的柠檬酸盐缓冲液中分钟以修复抗原，当切片充分冷却后以PBS 洗涤切片3 次，在切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，置于室温下孵育10 min，再次以PBS 洗涤3 次，滴加封闭液，室温下静置封闭1 h。根据说明书将小鼠PGRN 抗体稀释至1∶200 并滴加到组织切片上，置于湿盒在4 ℃冰箱过夜。空白对照操作同前，仅用PBS 代替一抗。将湿盒中的切片取出置于室温下复温45 min 后再以PBS 洗涤3 次，每次3 min。滴加二抗（羊抗兔IgG），室温孵育30 min，PBS 洗涤切片3 min×3 次；按试剂盒说明书配制DAB 显色液，向组织上滴加DAB 显色液显微镜下观察，当出现阳性棕色颗粒时，将组织置于自来水中，终止反应。以苏木素染细胞核，不同梯度酒精进行脱水，二甲苯透明后以中性树胶封片。

1.5 Western Blot 检测肺组织PGRN 蛋白的表达

内参选用GAPDH。裂解液对肺组织进行处理，用细胞质/核蛋白提取试剂盒提取总蛋白，定量采用二啉甲酸（Bicinchoninicacid，BCA）法，再进行上样电泳，经一抗4 ℃孵育一夜后，转入聚偏氟乙烯膜，再经TRIS-HCL 缓冲盐溶液洗涤后加入二抗，37 ℃下孵育1 h，充分漂洗，目的条带采用电化学发光法显色，扫描仪扫描，灰度值分析使用IMAGE J软件。蛋白表达水平的计算方法是各样本中PGRN 条带的灰度值/GAPDH 灰度值。

1.6 统计学方法

使用SPSS 19.0 软件进行统计学处理，计量资料 以 均 数±标 准 差（±s）表 示，采 用t检 验 对BLM14 d 组与Sham 组、BLM28 d 组与Sham 组两组间小鼠肺组织PGRN 蛋白的表达水平分别比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

小鼠造模过程中存在自然死亡， Sham 组死亡1只、BLM14 d 组死亡2 只、BLM28 d 组死亡4 只。第28 天时博来霉素组小鼠呼吸频率明显增快，全身毛发晦暗无光泽，体重减轻。

2.2 小鼠肺组织HE 染色

Sham 组小鼠肺泡结构较为完整，肺泡内及间质可见少许炎性细胞浸润，BLM14 d 组小鼠肺泡结构开始出现破坏，肺泡间隔增厚，肺泡及间质均有较多炎性细胞浸润，BLM28 d 组小鼠肺组织病变更重明显，肺泡结构严重破坏，肺泡间隔明显增厚，肺泡及肺间质大量炎性细胞浸润，见图1A。Masson染色后观察发现，BLM14 d 组小鼠肺组织结构紊乱，肺泡间隔增厚明显，部分间质纤维化。BLM28 d 组小鼠肺泡腔被胶原纤维填充，肺泡间隔消失，胶原纤维连结成片，见图1B。

2.3 通过免疫组织化学染色法光镜观察

PGRN 在BLM14 d 组小鼠肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞中表达较Sham 组升高，而BLM28 d 组小鼠肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞中表达较BLM14 d 组升高更为明显。见图1C。

2.4 Western blot 结果

BLM28 d 组小鼠肺组织中PGRN 蛋白表达水平（0.60±0.18）较Sham 组（0.17±0.02）升 高（t=7.924，P＜0.001），BLM14 d 组小鼠肺组织中PGRN蛋白表达水平（0.22±0.06）较Sham 组（0.17±0.02）升高（t=2.614，P=0.017），差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 小鼠肺组织PGRN 蛋白比较Fig 2 Comparison of PGRN protein of mice lung tissue

3 讨论

IPF 是以进行性肺纤维化为特点的慢性肺退行性疾病，诊断后的总生存期3～5 年［4］。目前抗肺纤维化的靶向治疗以尼达尼布和吡非尼酮为主，仅能从一定程度上延缓肺纤维化，能接受肺移植手术并成功的患者只是极少数，亟待探寻IPF 的新型生物标志物和治疗新靶点。PGRN 是一种多效生长因子，广泛表达于多种组织细胞中并参与调节生长、迁移和转化，能竞争结合TNFR 的胞外区域，阻断TNF-α 介导的NF-κB 等多种信号通路［3］，已成为多种肿瘤、神经退行性变及炎症性疾病的生物标志物及治疗靶点，同时在损伤修复过程中起着至关重要的作用［5］。

纤维化是多种组织器官慢性疾病或损伤后的共同病理特征［6］。皮肤、肝、心脏、肺等多种器官均可因各种病变和损伤后进行性纤维化和组织重塑，进而导致器官损伤、功能衰竭甚至死亡［7］。已有多项研究发现PGRN 可能参与组织、器官纤维化的过程。Yang 等［8］观 察 到PGRN 可 通 过 上 调 转 化 生 长因子-β I 型受体，增强转化生 长因子-β/Smad3 信号通路，促进博莱霉素诱导的皮肤硬化。另一项研究却与之相反，该研究发现PGRN 过表达降低了α-平滑肌肌动蛋白、血清反应因子和结缔组织生长因子表达水平，从而减轻创面修复时皮肤的纤维化［9］。重组PGRN 干预后可减轻兔缺血再灌注2 周后约10%的心肌纤维化［10］，进一步对PGRN 敲除小鼠建构急性心肌梗死模型，发现PGRN 缺乏降低了心肌梗死后的存活率，增加了心肌的纤维化［11］。Yoo等［12］发现PGRN 可通过抑制NF-κB 的磷酸化、抑制巨噬细胞活化、减少胶原沉积进而减轻四氯化碳导致的肝脏损伤、炎症和纤维化。小儿戈谢病患者血清PGRN 水平与肝僵硬度升高相关，有望成为肝纤维化的无创检测手段［13］。

目前PGRN 在呼吸系统疾病中的基础研究多围绕急性肺损伤、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病进行。如Chen 等［14］发现PGRN 可能通过促进Treg分化和激活白细胞介素-10 在脂多糖诱导的急性肺损伤中发挥保护作用。PGRN 还可以通过抑制HMGB1 调节自噬改善屋尘螨诱导的慢性哮喘的气道 重 塑［15］。 血 清PGRN 水 平 与COPD 患 者FEV1% pred 呈负相关，与中性粒细胞与淋巴细胞比率、C 反应蛋白呈正相关［16］。当前PGRN 在间质性肺疾病或肺纤维化中的研究多以探索其生物学标志物价值为主。有研究发现影像学表现为寻常型间质性肺炎特征的患者血清PGRN 正常，而影像学表现为非寻常型间质性肺炎的患者PGRN 明显升高［17］，因此认为PGRN 可用于鉴别IPF 与非IPF类型的间质性肺疾病。在前期研究中发现IPF 患者在急性加重时血清中的PGRN 水平明显高于稳定期IPF 患者［18］。MDA5 阳性皮肌炎合并快速进展性间质性肺疾病的PGRN 水平明显升高［19］，PGRN 有望成为其生物学标志物。

在PGRN 与间质性肺疾病的基础研究方面，王梦祝等［20］发现PGRN 在矽肺小鼠模型肺组织中高表达，并促进肺成纤维细胞增殖和分化。目前PGRN 在博来霉素建立的肺纤维化模型小鼠中的研究鲜见报道，本研究对PGRN 在肺纤维化小鼠肺组织中的表达做了初步的观察研究，成功地通过气道内灌注博来霉素建立了小鼠肺纤维化模型。通过免疫组织化学染色法发现，无论是第14 天还是28天，PGRN 在博来霉素气道灌注后的小鼠肺组织中的表达都高于Sham 组，且其分布以肺泡巨噬细胞和上皮细胞为主。Western Blot 法检测发现PGRN在博来霉素气道灌注小鼠肺组织中的蛋白表达水平无论是第14 天还是28 天均明显高于Sham 组，差异均具有统计学意义，初步提示PGRN 参与肺纤维化发生、发展的可能。本研究仅为观察性研究，尚存在诸多不足之处，例如无法明确PGRN 在肺纤维化的作用到底是上游启动因素还是其他炎症反应导致的下游改变。接下来还需要通过敲除或敲低小鼠PGRN 基因后并给予外源性PGRN 处理，观察小鼠气道灌注博来霉素后肺部炎症及纤维化的变化，从而明确PGRN 在肺纤维化中起到保护性抗炎抗纤维化作用还是增加炎症及纤维化程度。此外还需要在体外细胞试验中进一步证实并从分子通路水平探讨其作用机制，以期对IPF 的发病机制和靶向治疗提供更多的理论依据。

作者贡献度说明：

刘洁婷：动物模型的建立、统计学分析和论文撰写，张蕾：病理学检测，赵洁：蛋白印迹法检测，谢甜：课题设计、实验指导和论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。