miR-301a 的上调通过PTEN/PI3K/AKT 信号轴诱导巨噬细胞M1 极化促进动脉瘤的进展

梁国新，郭 畅，唐红悦，刘 欣，张明明

（1.华北理工大学研究生院，河北 唐山 063000；2.河北省人民医院临床医学研究中心，河北 石家庄 050051；3.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 075132；4.河北医科大学研究生学院，河北 石家庄 050000）

腹主动脉瘤（AAA）是一种严重的血管疾病，定义为主动脉病理性扩张超过正常直径50%。AAA的死亡率很高，其中主动脉破裂是主要原因之一［1］。大量研究表明，血管生成和炎症浸润在促进AAA的发生和发展中起着重要作用。研究表明AAA 形成的一个标志是外膜和内侧动脉中炎性细胞的病理性浸润，巨噬细胞和CD4+T 细胞在AAA 的主动脉浸润中占主导地位［2，3］。浸润和驻留的活化巨噬细胞通过产生促炎细胞因子（肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）［4］和基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）促进主动脉壁内细胞外基质降解并激活胶原蛋白酶造成弹力纤维破坏，从而造成血管壁弹性减弱最终发展成动脉瘤［5］。两种巨噬细胞亚群参与了腹主动脉瘤的发展，促炎表型M1 负责合成促炎分子和MMP，从而促进AAA 的形成［6］；相反，M2 发挥抗炎作用，并有助于组织修复。M2 的保护特作用已被研究证实［7］。因此调控参与的巨噬细胞的表型，可以控制动脉瘤的进展。

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一种长度21～24 个核苷酸、具有生物活性的内源性非编码功能RNA 序列，它与蛋白质编码基因3′端非翻译区（3′-UTR）中的特定互补序列相互作用，通过抑制蛋白质翻译或转录产物的降解来抑制靶基因的表达［8，9］。miR-301a 是miRNAs 家族的成员，miR-301a参与细胞炎症、凋亡、免疫调节和血管生成等病理过 程［10-12］。miRNA-301a-3p 通 过 靶 向KLF7 增 加 氧低密度脂蛋白诱导的人脐静脉血管内皮细胞的氧化应激、炎症和凋亡，促进动脉粥样硬化的进展［13］。miR-301a-3p 可调节PTEN/PI3K 轴介导巨噬细胞极化［14］。然而，miR-301a 能否通过调节巨噬细胞极化促进AAA 仍有待进一步的探究，本研究旨在探索miR-301a 调节巨噬细胞极化参与AAA 进展的机制，为抑制动脉瘤的形成和进展提供新的思路。

1 对象和方法

1.1 伦理、参与者

本研究经河北省人民医院伦理委员会批准（审批号：2020291）。组织样本和血清来自包括；所有新发现的完整（未破裂）动脉瘤患者（n=18），接受择期开放AAA 修补术；因动脉瘤破裂而入院的患者（n=6）；健康对照组（n=10）取选自相同年龄和性别的志愿者。组织样本收集于手术室，在AAA患者术前和健康志愿者收集血液样本离心获得血清。所有参与者均已知情同意。

1.2 实验动物、建模和分组

所有动物实验均遵循当地动物护理和使用委员会的规定进行，并经河北省人民医院伦理委员会批准（伦理审批号：202104）。8～10 周龄载脂蛋白E敲除小鼠（APOE-/-，C57BL/6J 遗传背景）小鼠，体重（22±2） g，购于河北伊维沃生物科技有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2020-002。动物实验在河北省人民医院临床研究中心的无特定病原体级动物房进行［实验动物使用许可证：SYXK（冀）2020-005］，自动控制系统针对适宜小鼠生存的温度及湿度等条件进行设定，自由进食饮水。适应性喂养后将小鼠分为两组，一组作为AAA 模型（n=45），通过微型渗透泵（型号：1004，Alzet，CA，USA）将1 000 ng/kg/min 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）长期注入小鼠中诱导AAA，另一组小鼠使用生理盐水作为对照组（n=15），28 d 后，杀死模型小鼠（n=6）和对照小鼠（n=6），取出主动脉并固定24 h，然后冷冻在-20 ℃下，并抽取血液以提取血清。为了研究miR-301a 在AAA 发展中的意义，将建成AAA 模型的小鼠分为3 组，每组8 只，分组如下：对照组、agomir NC 组（用无意义片段处理的组）、miR-301a agomir 组。agomir NC 组、agomir miR-301a 组 小 鼠分别尾静脉注射agomir NC、agomir miR-301a，剂量为0.3 mol/kg 加到0.1 mL 生理盐水中，每周2 次注射到小鼠，第7 天收集血液并处死小鼠收集动脉标本冷冻至-80 ℃直至分析。

1.3 细胞培养和转染

THP-1 细胞株（人单核细胞白血病细胞THP-1细胞株）购自于武汉普诺赛生命科技有限公司，培养于37 ℃、5% CO2条件下的培养瓶中，培养基为1%双抗、10%FBS 的RPMI1640 完全培养基，将处于对数生长期的THP-1 细胞传代传，进行后续实验。当细胞处于对数生长期且状态良好时加入浓度 为100 ng/mL 的PMA，48 h 后THP-1 细 胞 成 熟为巨噬细胞，从悬浮状态变为贴壁细胞。更换新鲜的培养基继续培养，当细胞融合到80%左右，使用0.25%胰酶消化细胞并计数，调整THP-1 细胞密度为5×105/mL，将细胞接种于24 孔板中加入完全培养基继续培养24 h。取50 μL OPTI-MEM 培养基稀释1 μL Lipofec-tamineTM3000 并充分混匀，取50 μL OPTI-MEM 培养基稀释20 pmol agomir NC /agomir 柔和混匀，在每管已稀释的 LipofectamineTM3000 试剂中，加入稀释的miR-301a agomir 或者agomir NC （1∶1 比例），轻柔混匀，室温放置20 min形成复合物。100 μL 的RNA-脂质体复合物加到细胞中。37 ℃孵育细胞48 h 后分析转染后的细胞.

1.4 生物信息学

本研究的GSE24194 数据集通过GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载。使用R 软件Edge R 包分析差异表达的miRNA，并将P＜0.05 定义为显着差异的阈值。基于TargetScan7.2和miRWalk 数据库预测miR-301a 的靶基因，并对靶基因进行基因本体（GO）和 KEGG 通路分析。

1.5 Western blotting

使用RIPA 裂解缓冲液（G2002，Servicebio）提取蛋白质，并在4 ℃下以12 000g离心15 min。从裂解物中提取蛋白质，使用BCA 蛋白质分析试剂盒测量其浓度，使用8%～12%分离胶进行SDS-PAGE分离，将解析的蛋白质电印迹到膜上，用5%脱脂奶封闭后，将膜与一抗4 ℃孵育过夜后，孵育二抗。采用凝胶成像仪拍照。ImageJ 软件对免疫反应条带进行定量。

1.6 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

qRT-PCR 根据试剂盒说明书进行，使用TRIzol 试剂提取总RNA，并通过分光光度法进行定量。对于miRNA 检测，在存在茎环的情况下对1 μg 总RNA 进 行 反 转 录，并 使 用Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit 试剂盒进行扩增。引物序列如下：miR-301a 的上游引物：5′-CGCGCAGTGCAATAGTATGT-3′，下 游 引 物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6 上 游 引 物：5'-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3'，下 游 引 物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6 作 为miR-301a 的内参。

1.7 荧光素酶活性测定

通 过TargetScan7.2（http：//www.targetscan.org/）预测miR-301a 的结合位点，构建了具有野生型或突变型PTEN 3'-UTR 的荧光素酶报告基因。根据制造商的方案，使用Lipofectamine3000（Invitrogen）将报告基因与miR-301a 模拟物或对照物共转染THP-1 细胞，转染后48 h，使用双荧光素酶报道基因测定系统（Promega）测量 光素酶活性。

1.8 酶联免疫吸附测定（ELISA）

根据制造商的试剂盒说明，使用ELISA 试剂盒检测AAA 小鼠血清中和THP-1 细胞上清中的单核细 胞 趋 化 蛋 白-1（MCP-1）、TNF-α、IL-1β 和IL-6浓度。

1.9 统计学分析

GraphPadPrism8.0 软件进行统计分析。数据以均数±标准差（±s）表示，夏皮罗-威尔克检验用于数据的正态性检验，然后进行方差齐性检验。两组间比较选择t检验；多组间采用单因素方差分析或曼-惠特尼U检验进行统计。皮尔逊相关系数用于衡量相关性。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-301a 在腹主动脉瘤模型中表达上调

与Control 组相比，AngⅡ诱导的AAA 组小鼠主动脉外径明显增加， AAA 组小鼠腹主动脉瘤发生率为66.67%（见图1A-B）；miRNA 微阵列数据显示miR-301a 在动脉瘤组织中表达上调（见图1C-D）；qRT-PCR 实 验 显 示，与Control 组 比 较，AAA 模型组的主动脉组织miR-301a 表达显著升高（见图1E，t=11.56，P＜0.001）；与Control 组比较，AAA 组小鼠血清中miR-301a 表达水平显著升高（见图1F，t=14.32，P＜0.001）。

图1 miR-301a 在腹主动脉瘤中高表达Fig 1 miR-301a is highly expressed in abdominal aortic aneurysm

2.2 miRNA 靶基因的预测及其功能注释

通过在线数据库共筛选出59 个miR-301a 的靶基因。并明确了miR-301a 在野生型和突变型PTEN 的3'-UTR 中的结合位点（图2A）；荧光素酶报告基因实验发现miR-301a 过表达显著抑制野生型PTEN 的萤光素酶活性，且差异具有统计学意义（t=14.72，P＜0.01），但miR-301a 模拟物不影响与突变型PTEN 3′-UTR 转染的THP-1 细胞中的荧光素酶活性。此外，miR-301a 模拟物阴性对照与野生型或者突变型PTEN 3'-UTR 转染的THP-1 细胞中，萤光素酶活性没有变化，差异无统计学意义（t=1.56，P=0.19） （见图2B）。接下来，GO 和KEGG数据库对目标基因进行功能注释。GO 显示phosphatidylinositol 3-kinase signaling 通路被富集（见图2C）；KEGG 途径分析揭示了PI3K/AKT、mTOR、MAPK、FOXO 等信号通路被显著富集（见图2D）。

图2 miR-30c-1-3p 靶基因的预测、GO 富集分析和KEGG 途径Fig 2 Prediction of miR-30c-1-3p target genes， GO enrichment analysis， and KEGG pathway

2.3 miR-301a 的上调是调控巨噬细胞极化促进动脉瘤进展的关键分子

如图3 所示，Western blotting 结果显示，与Control 组 比 较，Ang Ⅱ+agomir NC 组 动 脉 组 织 中p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1β 水 平 显 著 升 高，同 时PTEN 的表 达 降 低；与Ang Ⅱ+agomir NC 比 较，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 组p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1ß 蛋白的表达水平显著提高，同时PTEN 蛋白的表达更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。ELISA 结果表明，与Control 比较，AngⅡ+agomir NC 组小鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-6 和IL-1β 水 平 显 著 升 高， AngⅡ+miR-301a agomir 组IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 血 清 促 炎 因 子 的 水 平 更 高（P＜0.05）。见图3。

图3 miR-301a 是AAA 中调控巨噬细胞活化的关键分子Fig 3 The miR-301a is the key player in regulating activation of M1 macrophages

2.4 过表达miR-301a 激活巨噬细胞中PI3K/AKT/NF-κB 信号通路

Western blotting 结 果 显 示，与Control 组 比 较，Ang Ⅱ+NC agomir 组 细 胞 中p-PI3K、p-Akt、p-IKKa/b、p-NF-κB p65 磷 酸 化 蛋 白 水 平 和iNOS、MMP9 和MCP-1 蛋白水平均显著增加（P＜0.05），PTEN 的表达显著降低（P＜0.05）；与AngⅡ+NC agomir 组 比 较，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 组p-PI3K、p-Akt、p-IKKa/b、p-NF-kB p65、iNOS、MMP9 和MCP-1 蛋 白 水 平 显 著 上 调（P＜0.05），PTEN 的下调更显著（P＜0.05），但这种调节作用可被PI3K 抑 制 剂LY294002 显 著 逆 转（P＜0.05）。见图4。

图4 过表达miR-301a 激活巨噬细胞中PI3K/AKT/NF-κB 信号通路Fig 4 Overexpression of miR-301a activates PI3K/AKT/NF-κB in macrophages signal pathway

2.5 miR-301a 过表达对AngⅡ处理的THP-1 细胞中炎症因子水平的影响

如 图5 所 示，ELISA 结 果 显 示，与Control 组 相比，Ang Ⅱ+NC agomir 组 上 清 液 中IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 的水平均显著升高（P＜0.05）；与Ang Ⅱ+NC agomir 组 比 较，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 组上述炎症因子的表达水平更高（P＜0.05）；而PI3K 抑制剂LY294002 可以逆转上述由miR-301a 过表达引起的AngⅡ诱导的THP-1 细胞中IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 的 水 平 变 化（P＜0.05）。

图5 miR-301a 过表达对AngⅡ刺激的THP-1 细胞IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 水平的影响Fig 5 Effect of miR-301a overexpression on IL-1β， IL-6， MCP-1 and TNF-α levels in AngII-stimulated THP-1 cells

2.6 AAA 血清中miR-301a 和MMP 的水平升可预测腹主动脉瘤破裂的风险

与对照组（1.70±0.18）相比，URAAA（4.21±0.85）和RAAA（5.51±0.46）组患者的动脉最大直径增大（见图6A，t=14.10，t=19.25，t=4.347，P＜0.05）；患者血清的MMP9 血清结果显示，与对照组（147.5±32.28）相 比，URAAA（423.7±64.22）和RAAA（543.2±49.39）组血清中miR-301a 浓度递增高（见 图6B，q=19.12，q=20.92，q=6.92，P＜0.05）；患者样本的miR-301a 血清结果显示，与对照组（0.39±0.09）相 比，URAAA（0.91±0.14）和RAAA（1.33±0.31）组中miR-301a 血清浓度递增（见图6C，t=11.83，t=7.322，t=3.241，P＜0.05）；双变量相关分析显示，腹主动脉瘤患者miR-301a 水平与主动脉最大直径呈正相关（图6D，r=0.682，P＜0.001），与MMP9 表 达 呈 正 相 关（图6E，r=0.727，P＜0.01）；MMP9 水平与主动脉最大直径呈正相关（图6F，r=0.656，P＜0.001）；受试者工作特征（ROC）曲线分析显示最大直径、MMP9 和miR-301a 的曲线下面积（AUC）依次为87.96%（95%CI，71.50%～100%）（ 图6G，P＜0.05）；94.44%（95%CI，85.47%～100%）（ 图6H，P＜0.01）；92.59%（95%CI，81.38%～100%）（图6I，P＜0.05）。

图6 AAA 患者miR-301a 表达上调Fig 6 miR-301a is upregulated in AAA patients

3 讨论

AAA 是一种严重的迟发性血管疾病，死亡率很高［15］。因此迫切需要寻找针对该病的有效防治措施。如前所述，miRNAs 已被证明是心血管系统生理稳态的重要调节因子［16，17］。使用高通量技术研究AAA 小鼠模型差异表达的miRNAs，发现miR-301a 是AAA 组织中一种新的上调miRNA。已有研究表明miR-301a 与免疫反应、炎症、肿瘤和血 管 生 成 密 切 相 关［12，18，19］，并 在 动 脉 粥 样 硬 化 中 起重要作用。然而，miR-301a-3p 促进AAA 进展的机制尚不清楚。本研究建立体内、体外模型、发现miR-301a-3p 在AAA 组织和THP-1 细胞中上调并与动脉瘤的直径呈正相关。此外使用生物信息学分析了miR-301a 促进动脉瘤进展的机制，研究结果表 明，miR-301a 通 过PTEN/PI3K/AKT 信 号 通 路诱导巨噬细胞向M1 极化，促进动脉瘤的进展。

AAA 的形成和发展是可逆的过程，动脉瘤的发生是一个复杂的过程，涉及多个因素的相互作用。这些因素包括动脉壁的结构异常、缺血和营养不足、高血压以及感染和炎症等。其中巨噬细胞极化起着至关重要的作用［20，21］。巨噬细胞作为机体免疫系统的重要组成部分，在慢性和急性炎症中都能发挥重要的作用，巨噬细胞通过分泌TGF-β 和IL-10等抑制性细胞因子下调免疫反应从而有效控制炎症［22］。miR-301a 在机体内包括巨噬细胞在内的各种组织细胞中广泛表达。巨噬细胞能促进动脉粥样硬化的形成和发展［23］。有研究证实miR-301a 能够引起慢性炎症［11］，miR-301a 可能参与AAA 的形成和发展，并与巨噬细胞的炎症有关。GO 和KEGG 通路分析显示miR-301a 靶标在PI3K/AKT、mTOR、NF-κB 和MAPK 等与炎症相关的信号通路中富集。PTEN/PI3K/AKT 途径在巨噬细胞极化中起重要作用，机制可能是因为NF-κB 是PI3K/AKT 信号下游的关键分子。而NF-κB 通路的激活与炎症反应密切相关，并在小胶质细胞M1 极化的病理学中发挥关键作用［24］。本研究显示，miR-301a上 调 p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1β 水 平，参 与 巨 噬 细 胞M1 极化，促进血管生成及动脉瘤的进展。大量研究表明，慢性炎症及动脉壁细胞外基质的病理性重构可能是动脉瘤发生和进展的重要机制。比如，各种炎性细胞的浸润促进了MMPs 的分泌，尤其是MMP9 的分泌，导致动脉管壁弹力纤维和胶原纤维的损伤而发病。而在浸润的炎性细胞中，以巨噬细胞的作用最为突出，巨噬细胞数量的增加可能导致MMP2 和MMP9 水平增加，从而导致动脉血管周围胶 原 纤 维 的 破 坏［25，26］。monocyte chemotactic protein-1，MCP-1 对巨噬细胞的浸润有着重要的调节作用，核转录因子（nuclear factor κB，NF-κB）则在转录水平调控了MCP-1 等促炎症基因的表达［27］。本研究发现miR-301a 升高增强了巨噬细胞中MMPs的表达，随后导致巨噬细胞渗透［28］。此外，还发现AAA 小鼠和转染 miR-301a 模拟物的THP-1 细胞中的炎症因子显著增加，表明miR-301a 的过度表达促进了炎症因子的释放和主动脉弹性蛋白的降解和破坏，从而导致增加AAA 的易感性。此外，使用PI3K 抑制剂能抑制巨噬细胞的极化。在AAA 进展过程中，miR-301a 表达升高并能抑制PTEN 表达，调控PI3K/AKT/NF-κB 信号通路促进巨噬细胞极化加速动脉瘤的进展。 此外本研究评估了miR-301a 和MMP9 在动脉瘤中的诊断价值，发现miR-301a 和MMP9 的水平能够很好的预测动脉瘤的破裂风险，是一种无创的潜在标志物。

总之，本研究表明，miR-301a 可以通过PI3K/AKT/NF-κB 信号通路调节巨噬细胞极化，参与AAA 中的炎症反应和血管生成，加速动脉瘤的进展。miR-301a 及其靶点为限制AAA 的形成提供了治疗思路。

作者贡献度说明：

张明明：构思该研究的思路；张明明、梁国新：实验方案设计；梁国新、刘欣、郭畅和唐红悦：进行实验；梁国新：进行初步的数据分析；郭畅、唐红悦：参与临床资料和样本的收集工作；梁国新：起草手稿；张明明和梁国新：数据分析，并撰写手稿，所有作者都批准了最后的手稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。