冷冻保存对猪精液品质的影响

文│张伟 于艳丽 （山东省潍坊市寒亭区畜牧业发展中心）

近年来，随着养殖业的发展和人们对食品质量的要求不断提高，猪精子的保存和运输成为养殖业界关注的焦点之一。冷冻保存作为一种常用的精子保存方法，被广泛应用于猪精液的收集、保存和运输过程中。然而，冷冻保存对猪精子品质的影响一直是一个备受争议的话题。因此，了解冷冻保存对猪精子品质的影响，对优化猪精液的保存和使用具有重要意义。本文旨在通过综述目前已有的研究成果，探讨冷冻保存对猪精子品质的影响，进一步分析影响因素以及可能的改善策略。

一、猪精液超低温保存机理

1.抑制冰晶形成。超低温保存是一种通过降低温度来减慢精子活动并抑制冰晶形成的方法。将精子置于极低温环境中，通常在-196～-80℃之间，可以减缓冰晶的形成速度，降低细胞内活动和代谢需氧量。为了进一步保护精子，在超低温保存过程中还可以添加冷冻保护剂来调节冰晶的形成速度和方式。常用的冷冻保护剂包括甘露醇、蔗糖、乳酸和胆固醇等。这些保护剂可以增加细胞内的渗透压，防止水分子结晶，并提供额外的保护作用。

2.降低新陈代谢率。在超低温下，细胞代谢活动减弱，导致化学反应速率和能量消耗减少，进而使细胞进入休眠状态。在超低温条件下，细胞氧需求降低，猪精液中的精子能保持活跃和充满能量。此外，代谢减慢也延缓了细胞衰老和死亡，提高了精子质量和数量。超低温还有助于减少自由基产生和氧化损伤，保护细胞免受损害。

3.防止冷冻引起的细胞膜破裂。超低温保存时细胞膜的完整性至关重要。冷冻过程可能导致细胞膜破裂，所以科学家提出了逐渐降温和升温保存的解决方案。首先，缓慢降温使细胞膜逐渐适应低温环境，减少机械应力产生。其次，谨慎逐渐升温有助于细胞膜恢复正常状态，减轻冷冻应力影响。此外，选择合适的保存容器如聚合物材料能提供更好的保护效果，减少与细胞膜之间的摩擦，避免机械应力的产生。

4.防止冷冻引起的氧化应激。

在超低温保存中细胞面临着一个严峻的挑战，即暴露在高浓度氧气环境中。这种情况会导致氧化应激反应的发生，并增加氧自由基的产生，从而对细胞的结构和功能造成损伤。为了降低氧化应激的负面影响，常见做法是添加抗氧化剂，如维生素C、E等。抗氧化剂具有中和自由基的作用，能减少对细胞的伤害，保护细胞的完整性。

二、猪精液特点

1.精子活力对精液质量非常重要，直接影响母猪的受胎率和产仔数。精子活力是在精液中能直线运动的精子所占的比例。检查精子活力时需要控制温度，因为温度变化会直接影响精子的活动能力。一般来说，精子的最适活动温度为37℃左右，这是因为在体内，精子在睾丸中形成，并在精液中储存，而体温通常维持在37℃左右。温度过高会使精子活动能力下降，数量减少，影响受孕率。温度过低会使精子变慢或停止活动，活动能力减弱，细胞膜受损。因此，在进行精子活力检查时需要确保温度适宜，通常会采取一些措施来控制温度，如使用恒温器或在实验室中使用恒温箱。这样可以确保精子处于最适活动范围，准确评估其活力水平，从而更好地指导母猪的繁殖管理，提高受孕率。

2.正常精液的颜色应该是灰白至乳白色。精液的浓度越高颜色越深。正常精液确实具有特殊的腥臊味，这是由于其中含有的蛋白质、酶和矿物质等成分所致。但正常精液不应有异味或臭味。如果出现异常气味可能是由于感染、炎症或其他健康问题引起的。

3.公猪精液的pH值通常呈弱碱性，在7～8之间。这个范围是精液正常的酸碱平衡状态，有利于精子的存活和受精。如果精液的pH值发生较大变化，超出了正常范围，可能表示精液质量较差。过低或过高的pH值都会对精子存活和活动能力产生不利影响。

4.精子密度是衡量精液质量的重要指标之一。通常需要在显微镜下观察。一般来说，每毫升精液中含有2亿个以上的精子被认为是“密集”的，1亿～2亿个精子被认为是“中等密度”，少于1亿个精子则被认为是“稀疏”的。

三、猪精液冷冻保存效果的影响因素

1.稀释液。稀释液在冷冻精液中起重要保护作用，对猪精液冷冻效果至关重要。实验方法不同，稀释液成分也存在差异，一般含蛋白质、糖类、脂类、冷冻保护剂、缓冲液及其他添加物。目前精液稀释比例尚无统一标准，但大比例稀释会增加冷冻损伤精子数。为避免甘油损伤精子，常采用两步法添加稀释液：先用不含甘油的稀释液稀释精液，在4℃冰箱平衡1～2小时，再加入含甘油的稀释液。这两步法可减少甘油对精子的损伤，更好地保护精子在冷冻过程中的存活率。

2.冷冻保护剂。冷冻保存剂是一种广泛应用于生物科学和医药领域的化学物质，旨在延长生物样本、细胞或组织的保存时间，并保持其活性和完整性。冷冻保存剂可分为有机和无机两大类。常见的有机冷冻保存剂包括甘油、丙二醇和二甲基亚砜等，这些物质通过降低细胞内溶液的冰点以及减少冰晶对细胞结构的损伤起到保护细胞的作用。无机冷冻保存剂主要是以盐类或糖类为代表，如氯化钠和蔗糖，在高浓度条件下形成渗透压，减少细胞内外溶质的水分差异，从而防止细胞脱水和冻结引起的损伤。选择合适的冷冻保存剂可以有效维持生物样本的完整性和功能性，确保其长期保存的可靠性。

研究证明，冷冻液中添加100微摩尔/升锰苯甲酸卟啉（MnTBAP）可以提高冷冻后猪精子的抗氧化能力，降低ROS的产生，从而提高MMP，降低DNA的损伤，改善了猪精子冷冻后的形态与动力学参数。

3.抗氧化剂。在精液冷冻过程中，维生素C和维生素E这两种抗氧化剂的添加在猪精液中起到的作用主要是保护精子免受氧化应激的损伤，从而提高精子的存活率和运动能力。这两种抗氧化剂在哺乳动物精液冷冻稀释液中的投入不仅可以增强解冻后精子的活力和活率，还有助于减少氧化应激引起的损伤。研究表明，在冷冻稀释液中添加600微克/毫升的维生素C或维生素E可以显著提高陆川猪精液的冷冻保存效果。当添加600微克/毫升的维生素C时，精子的存活时间可以达到113.18小时，活力可以达到42.88%。而当添加600微克/毫升的维生素E时，精子的存活时间可以达到120.24小时，活力可以达到42.97%。维生素C是一种抗氧化剂，可以帮助减少氧化应激对精子的损伤，从而延长精子的存活时间。维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，可以与细胞膜中的脂质相互作用，阻止自由基对脂质的氧化反应，从而保护精子质膜的完整性。

4.储存温度。温度对精液质量非常重要。在精液离开受精中心过程中，应避免高温环境（24℃以上），尽量保持在16～17℃的温度范围内。如果需要可以进行制冷以达到适宜温度，并且要避免温度剧烈变化。其次，在精液到达猪场前的运输阶段也是问题产生的关键。很多时候，人们错误地认为问题出在猪场精液储存上，实际上问题可能出在运输阶段。因此，在整个运输过程中都要注意温度控制，避免温度过高或过低。

最好选择足够大的冰箱来存放精液，并将温度保持在15～17℃之间。同时要避免将精液放置在加热元件、冷冻室或后壁附近，因为这些区域的温度波动较大，超出了精液储存的温度范围。其次，精液放置位置也很重要。避免将其留在输送袋内，因为不正确的位置可能导致精子沉积不当，阻止其与稀释液接触，从而导致精子缺乏营养并丧失活力。最好将精液一层层地平放，如果是管状的，以相反的方向将其一层层平放。如果是放在托盘中的罩板包装，则应将其放置在这样一个位置，当倒出精液时它会留在较宽的表面上，并且大多数精子可以与稀释液接触。为了确保精液的均匀，应定期移动精液，使其中的成分均匀混合。在授精前可以轻轻摇晃或轻轻搅拌精液，使其中的成分均匀分布。

5.解冻温度与速度。首先，解冻温度对精子存活有重要影响。研究表明，在3种不同的解冻温度下（分别为37℃、50℃和70℃），随着解冻温度的升高，冻后精子的活力呈上升趋势，并且最高解冻温度下的平均冻后活力约为最低解冻温度下的1.7倍。由此可见，较高的解冻温度能促进精子的存活和活力恢复。

其次，解冻速度也会对精子存活产生影响。不同类型的精液冷冻方法可能对解冻速度有不同的要求。如一项研究发现，相较于以38℃慢速解冻的冷冻精液，采用50℃快速解冻的猪细管冷冻精液可以获得更好的精子活力和顶体完整率。另外，另一项研究发现，在使用0.25毫升细管冷冻猪精液时，采用37℃水浴解冻30秒的方法可以获得更好的顶体完整率和精子活力。