新型卟啉苦马豆素衍生物的合成及抗肿瘤活性

张志辉,王淑勋

(石家庄四药有限公司,河北 石家庄 052165)

作为研究糖蛋白N-连接寡糖合成的工具药物—苦马豆素(Swainsonine,SW)由澳大利亚学者COLEGATE等从灰苦马豆中分离得到[1]。研究发现,苦马豆素具有抗肿瘤、抗病毒的作用[2-3],国外已经将其作为新抗肿瘤药物进行三期临床实验[4-6]。但苦马豆素在体内组织分布不均匀,且浓度超过一定值就会产生毒性,致使使用剂量难以控制。将卟啉类化合物与具有抗肿瘤活性的化合物拼合成卟啉-抗癌药物,如卟啉-硼中子俘获(BNCT)[7-8]、卟啉-顺铂[9-10]、卟啉-氮芥[11-12]、卟啉-氟脲嘧啶[13]和4-氨基苯基三苯基卟啉-齐多夫定[14]等,可以使抗癌药物选择性地富集于肿瘤组织中,减少其在正常组织中的分布,降低其毒副作用[15]。

本文将氨基卟啉或羟基卟啉与苦马豆素经磷酰化反应,合成了7个新型卟啉苦马豆素衍生物,并对其抗肿瘤活性进行了测试,希望获得新型高效的抗肿瘤药物。衍生物1a～1g的合成路线如图1。

图1 1a～1g的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Brucker Avance DMX500型核磁共振仪(CDCl3为溶剂,TMS为内标,NMR,德国Bruker公司);Autopol IV 型旋光仪(美国鲁道夫公司);LCQ型质谱仪(赛默飞世尔公司);EA 2400 II型元素分析仪(美国珀金埃尔默公司);二氧化碳培养箱(上海STIK公司); Labsystems型酶标仪(赛默飞世尔公司);苦马豆素(上海懋康生物科技有限公司);人胃癌(SGC-7901)细胞和人食管癌(Eca-109)细胞(上海复祥生物科技有限公司);氨基卟啉、羟基卟啉2a～2g按文献[16-18]制备,其它试剂均为分析纯。

1.2 衍生物1a～1g的合成

N2氛围下,在1000 mL圆底烧瓶中加入氨基卟啉或羟基卟啉(2a～2g)(1.0 mmol)和400 mL无水二氯甲烷,控制温度-20 ℃,加入新蒸三氯氧磷(n×1.2 mmol,n为卟啉分子上氨基或羟基的个数),用恒压滴液漏斗缓慢滴加50 mL无水三乙胺的二氯甲烷溶液(n×1.5 mmol),反应4 h后,加入苦马豆素(3,n×1.1 mmol)和无水三乙胺(n×3.0 mmol),自然升至室温,反应8 h,反应完毕,用质量分数为5%的NaHCO3溶液(3×150 mL)洗涤,然后水洗至中性。减压蒸干溶剂,以二氯甲烷∶乙酸乙酯=5∶2,V∶V(浓氨水调pH=9)作为淋洗液,快速硅胶层析,得到衍生物1a～1g。

1a:收率51%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.94(d,J=4.8 Hz,2H),8.84(s,6H),8.21(d,J=8.0 Hz,6H),7.99(d,J=8.4 Hz,2H),7.77～7.73(m,9H),7.04(d,J=8.4 Hz,2H),4.25～4.23(m,1H),4.14(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),4.11(s,1H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.50(t,J=9.4 Hz,1H),2.0(s,1H),1.95～1.88(m,3H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3Hz,1H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.76(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.11,HR-MS(ESI)m/z:846.3[M]+,C52H43N6O4P元素分析计算值(实测值)/%:C,73.75(73.87); H,5.12(5.10); N,9.92(9.88); P,3.66(3.62)。

1b:收率46%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.93(d,J=2.8 Hz,4H),8.82(s,4H),8.22～8.20(m,4H),7.99(d,J=8.0 Hz,4H),7.75～7.71(m,6H),7.06(d,J=8.0 Hz,4H),4.25～4.23(m,2H),4.14(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,2H),4.10(s,2H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,2H),2.83～2.78(m,4H),2.50(t,J=9.4 Hz,2H),2.0(s,2H),1.95～1.88(m,6H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,2H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,2H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,2H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.07; HR-MS(ESI)m/z:1078.3[M]+; C60H56N8O8P2元素分析计算值(实测值)/%:C,66.78(66.70); H,5.23(5.21); N,10.38(10.35); P,5.74(5.71)。

1c:收率47%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.92(d,J=4.8 Hz,4H),8.82(d,J=4.8 Hz,4H),8.22～8.20(m,4H),7.98(d,J=8.4 Hz,4H),7.75～7.69(m,6H),7.04(d,J=8.4 Hz,4H),4.24～4.22(m,2H),4.15(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,2H),4.13(s,2H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,2H),2.82～2.77(m,4H),2.51(t,J=9.4 Hz,2H),2.0(s,2H),1.95～1.88(m,6H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,2H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,2H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,2H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.08; HR-MS(ESI)m/z:1078.3[M]+; C60H56N8O8P2元素分析计算值(实测值)/%:C,66.78(66.72); H,5.23(5.20); N,10.38(10.34); P,5.74(5.70)。

1d:收率45%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.08(d,J=4.8 Hz,4H),8.82(d,J=4.8 Hz,4H),8.40～7.75(m,8H),7.50～6.82(m,8H),4.24～4.22(m,4H),4.15(dd,J=5.6 Hz,3.7Hz,4H),4.12(s,4H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,4H),2.83～2.77(m,8H),2.50(t,J=9.4 Hz,4H),2.1(s,4H),1.95～1.89(m,12H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,4H),1.40(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,4H),1.13(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,4H),-2.74(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-7.09; HR-MS(ESI)m/z:1542.5[M]+; C76H82N12O16P4元素分析计算值(实测值)/%:C,59.14(59.09); H,5.36(5.32); N,10.89(10.83); P,8.03(8.01)。

1e:收率42%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.89(d,J=4.8 Hz,2H),8.83～8.81(m,6H),8.07～8.05(m,8H),7.88(dd,J=7.6 Hz,2.8 Hz,6H),7.16(d,J=8.0 Hz,2H),4.25～4.23(m,1H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),3.68(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.50(t,J=9.4 Hz,1H),2.0(s,1H),1.96～1.89(m,3H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,1H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.86(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3),δ:-3.87; HR-MS(ESI)m/z:1083.0[M]+; C52H39Br3N5O5P元素分析计算值(实测值)/%:C,57.58(57.60); H,3.62(3.60); Br,22.10(22.12); N,6.46(6.44); P,2.86(2.82)。

1f:收率43%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:8.87(m,8H),8.09(d,J=8.2 Hz,8H),7.20(d,J=8.0 Hz,8H),4.25～4.23(m,4H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,4H),3.68(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,4H),2.83～2.78(m,8H),2.50(t,J=9.4 Hz,4H),2.0(s,4H),1.96～1.89(m,12H),1.60(br,d,J=13.8 Hz,4H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,4H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,4H),-2.71(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3)δ:-5.67; HR-MS(ESI)m/z:1546.4[M]+; C76H78N8O20P4元素分析计算值(实测值)/%:C,58.99(58.93); H,5.08(5.05); N,7.24(7.22); P,8.01(8.02)。

1g:收率48%,m.p.>300 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.04～8.94(m,8H),8.33(t,J=4.0 Hz,6H),8.13(m,2H),7.96～7.91(m,9H),7.33(d,J=8.0 Hz,2H),4.24～4.23(m,1H),4.13(dd,J=5.6 Hz,3.7 Hz,1H),3.69(td,J=10.2 Hz,4.2 Hz,1H),2.83～2.78(m,2H),2.51(t,J=9.4 Hz,1H),

2.0(s,1H),1.95～1.89(m,3H),1.61(br,d,J=13.8 Hz,1H),1.41(qt,J=13.3 Hz,4.3 Hz,1H),1.14(qd,J=12.4 Hz,4.3 Hz,1H),-2.79(s,2H);31P(161.7 MHz,CDCl3)δ:-5.66; HR-MS(ESI)m/z:895.3[M]+; C52H42N5O8P元素分析计算值(实测值)/%:C,69.71(69.73); H,4.73(4.70); N,7.82(7.79); P,3.46(3.43)。

1.3 1a～1g的抗肿瘤活性测试

选对数生长期的人胃癌(SGC-7901)细胞和人食管癌(Eca-109)细胞,分别将它们的浓度调整为5×105/mL,按每孔100 μL接种于96孔培养板中。置37 ℃、5% CO2培养箱内培养24 h后,分别加入10 μmol/L的苦马豆素(SW,阳性对照组)和卟啉苦马豆素衍生物(1a～1g),空白对照组加等量的培养液。将培养板移入CO2孵箱中,在37℃,5% CO2及饱和湿度条件下,培养20 h。在96孔培养板中每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L),再将培养板移入CO2孵箱中,在37 ℃,5% CO2及饱和湿度条件下,继续培养4 h,终止培养,吸弃孔内上清液。每孔加入100 μL二甲基亚砜,震摇10 min,使紫蓝色结晶物充分溶解。用酶标仪以570 nm波长测定各组的吸光度A值。以Mosmann法计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 1a～1g的合成

采用一锅法合成衍生物1a～1g,反应过程应保持隔绝空气无水状态,氨基卟啉或羟基卟啉与POCl3反应温度为-20 ℃,生成卟啉磷酰二氯后,再缓慢升温至室温,与苦马豆素进行酯化反应。该反应中,升高温度对反应有利,室温为最佳,高于室温,苦马豆素可能出现消旋化现象,副产物增多。化合物结构经核磁共振、质谱和元素分析得到确证。

2.2 1a～1g的抗肿瘤活性

在10 μmol/L用量条件下,测试1a～1g对人胃癌(SGC-7901)细胞和人食管癌(Eca-109)细胞的抗肿瘤活性(表1)。由表1看出,1a～1g均显示出一定的抗肿瘤活性。其中,1c对SGC-7901的IC50为1.77±0.14 μM、对Eca-109细胞的IC50为3.32±0.13,抑制活性强于母药苦马豆素。1a的抗肿瘤活性与1g相当,说明卟啉以氨基与磷酰基相连接或以羟基与磷酰基相连接对抗肿瘤活性影响不大。1a和1g的抗肿瘤活性强于母药SW,说明卟啉起到了带动抗癌药物SW选择性地富集于肿瘤组织,减少其在正常组织中的分布作用。1a～1g的抗肿瘤活性显示出较大的差异,1c的抗肿瘤活性显著优于1a和1g,说明卟啉分子连接的苦马豆素的数量与抗肿瘤活性成正相关,但是,虽然异构体1b与1c都连有2个SW分子,但1b的活性却较差,说明衍生物分子结构的位阻大小也影响其抗肿瘤活性,1d与1f的IC50值与抑制活性的大小也进一步证明了这个观点。总之,卟啉苦马豆素衍生物的药理测试结果表明:磷酸酯和磷酰胺均可以作为卟啉与苦马豆素的连接臂;位阻小的顺式卟啉连接SW分子,抗肿瘤活性好;在适宜的结构位阻情况下,连接苦马豆素分子数量越多,抗肿瘤活性越强。

表1 1a～1g的抗肿瘤活性(¯χ±s,n=6)

3 结论

设计合成了7个新型卟啉苦马豆素衍生物并确证了其结构。1a～1g对人胃癌(SGC-7901)细胞和人食管癌(Eca-109)细胞均表现出了一定的抑制活性,1c对SGC-7901和Eca-109的抑制活性强于母药苦马豆素,有望获得一种新的抗癌药物。