基于谱-效关系筛选菊茎叶总黄酮抗氧化物质基础及其机制探讨

巫梦莹,陈慧芳,2,程冉冉,丁杨飞,熊俊伟,夏成凯,吴德玲,4,5,6,张 伟,4,5,6*

1安徽中医药大学药学院,合肥 230012;2安庆医药高等专科学校,安庆 246052;3亳州职业技术学院 安徽中药材种植联合研究中心,亳州 236800;4安徽中医药大学国家中医药管理局中药炮制技术传承基地;5省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心;6中药饮片制造新技术安徽省重点实验室,合肥 230012

菊花有着悠久的临床应用历史,随着对菊花中活性成分研究的不断深入,菊花有关加工产品越来越多,而菊茎叶作为菊花采收副产物,通常作为畜牧饲料使用或被丢弃[1],目前还缺乏深入系统的研究。前期研究表明,菊花茎叶中含有黄酮类、酚酸类、多糖类、挥发油类、核苷类、氨基酸类等资源性化学成分,与菊花成分多为相似[2,3],同样具有抗氧化、抗炎、降低血脂、改善肠道功能失调等药理作用[4-6]。目前已有研究表明菊茎叶总黄酮(total flavonoids from stems and leaves ofChrysanthemummorifolium,TFCSL)具有良好的抗菌、抑制自由基作用,此外,菊茎叶提取物对过氧化叔丁醇诱导的人肝细胞氧化应激也具有一定的保护作用[7-9]。因此菊茎叶也可以作为总黄酮类活性成分的提取原料,这对减少资源浪费有重要意义。

中药谱效关系研究是将中药中各成分的指纹图谱与药效结果联系起来,通过多种数据处理模型阐明各成分对药效贡献率,从而确定出与药效相关的化合物群[10]。网络药理学是一种药物研究的新模式,交叉应用于靶点预测、作用机制及生理病理过程分析,多角度建立药物相关靶点,进而揭示复杂疾病机制[11]。分子对接是计算机辅助药物设计的一种方法,从分子水平阐明中药活性成分与靶点的相互作用及位置。血管内皮细胞通过分泌具有调节血管功能的活性物质维持动态平衡,高糖会导致人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增加活性氧的生成量,进而产生氧化应激,造成其功能障碍。同时测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平能更准确地反映血管内皮细胞内氧化应激状态。本研究通过建立不同批次TFCSL指纹图谱,探讨共有峰与抗氧化应激活性的相关性,从而筛选物质基础;利用Gene Cards和OMIM等数据库筛选疾病靶点,构建中药-成分-靶点网络,预测抗氧化关键作用靶点及机制;结合分子对接探索小分子与蛋白之间的相互作用,以期提高菊花采收副产物菊茎叶的利用价值,为后期菊资源的综合开发利用提供理论依据,提高中药的资源再利用。

1 材料与方法

1.1 试验药物

12批菊茎叶样品(S1～S12)在2021年11月均采集于亳州谯城区,经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥茎叶。

1.2 细胞

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(批号:22053101,苏州北纳创联生物技术有限公司),于内皮细胞专用培养基(endothelial cell medium,ECM)中培养。

1.3 试剂

ECM培养基(批号35924,ScienCell Research Laboratories);磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(批号CR0013,SparkJade);胰酶细胞消化液(2.5%胰酶)(批号C0201,Beyotime);总超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、微量丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号20220402、20220408、20220908,南京建成生物工程研究所);增强型CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号CA0001、EC0001,碧云天生物技术研究所);香叶木素、芹菜素、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸B、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、绿原酸(批号MUST-21061005、MUST-21040401、MUST-21040401、MUST-21030602、MUST-19010201、MUST-21030304,成都曼思特生物科技股份有限公司);异绿原酸C、隐绿原酸、咖啡酸(批号:PS001057、PS001110、PS010522,成都普思生物科技有限公司);芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、异鼠李素(批号:CFS201502、CFS202004、CFS202103,武汉天植生物技术有限公司),纯度均>98%;葡萄糖(批号C220410F2,湖北科伦药业有限公司);HPLC级甲酸(批号C13217140,上海麦克林生化科技有限公司),纯度≥99%;抗坏血酸(Vc)(C12873349,纯度>99%,上海麦克林生化科技有限公司);HPLC级乙腈(批号20210531,纯度≥99%,安徽天地高纯溶剂有限公司)。

1.4 仪器

LC-20ADXR型高效液相色谱仪(日本岛津公司,二极管阵列检测器,四元低压泵,自动进样器);SpectraMax iD5型荧光酶标仪(美国Molecular Devices 公司)。

1.5 方法

1.5.1 菊茎叶总黄酮HPLC指纹图谱的建立

1.5.1.1 溶液的制备

精密称定25.0 g菊茎叶粉末,在85 ℃下分别按照1∶20、1∶15、1∶15的比例加入50%乙醇,加热回流,合并浓缩提取液。调节提取液pH为4.0,4 000 r/min离心10 min,保留上清液。将AB-8大孔树脂与上清液2∶1装柱,先后以水、70%乙醇冲洗,收集70%乙醇洗脱物[12],蒸干,即得TFCSL。取适量用70%甲醇溶解稀释,作为供试品溶液。

精密称定绿原酸、异绿原酸C、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、异鼠李素、异绿原酸B、隐绿原酸、芦丁、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、香叶木素适量,置容量瓶中,加70%甲醇定容,作为混合对照品溶液。

1.5.1.2 色谱条件

XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.2%甲酸(B);梯度洗脱(0～5 min,8%A→10%A;5～11 min,10%A→14%A;11～14 min,14%A→17%A;14～18 min,17%A→17.5%A;18～28 min,17.5%A→18%A;28～33 min,18%A;33～43 min,18%A→18.5%A;43～53 min,18.5%A→19%A;53～68 min,19%A→30%A;68～83 min,30%A→52%A;83～85 min,52%A→8%A;85～90 min,8%A);柱温:30 ℃;检测波长:348 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL。

1.5.1.3 方法学考察

精密度:取同一批次TFCSL样品,按“1.5.1.1”项下方法制备供试品溶液,按照“1.5.1.2”项下色谱条件,连续进样6次,采集图谱,计算各共有峰峰面积及保留时间的RSD值。

重复性:取TFCSL样品,按“1.5.1.1”项下方法重复制备供试品溶液6份,按照“1.5.1.2”项下色谱条件进样采集图谱,计算各共有峰峰面积及保留时间的RSD值。

稳定性:取TFCSL样品,按“1.5.1.1”项下方法制备供试品溶液,分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“1.5.1.2”项下色谱条件进样测定,计算各共有峰峰面积及保留时间的RSD值。

1.5.1.4 相似度评价

将12批TFCSL样品指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”进行相似度分析。

1.5.2 菊茎叶总黄酮对高糖诱导HUVEC氧化损伤的保护作用

1.5.2.1 葡萄糖诱导细胞氧化应激损伤模型的最佳浓度的筛选

HUVEC采用专用培养基ECM于37 ℃,5%CO2条件下培养[13]。取生长状态良好的HUVEC细胞,调整细胞密度为8×103个/孔,接种于96孔板中,并置于CO2培养箱进行培养,待细胞贴壁并且状态稳定后,弃去原有的培养基,PBS清洗后加入含1%血清的培养基饥饿处理12 h。弃去原先孔板中的培养基,PBS清洗后加入不同浓度梯度葡萄糖溶液(10、20、30、40、50、100、150、200 mmol/L)建立氧化损伤模型,每个浓度设三个复孔,置于CO2培养箱中培养24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液,轻轻摇匀后,在37 ℃下避光孵育2 h,450 nm下测定其吸光度值,按照公式(1)计算细胞存活率(R),实验重复三次。

R=[(A1-A2)/(A3-A2)]×100%

(1)

式中,A1为给药组吸光度值,A2为空白组吸光度值,A3为对照组吸光度值。

1.5.2.2 筛选菊茎叶总黄酮对高糖诱导细胞氧化应激损伤保护作用的最适浓度

细胞接种于96孔板中,设置8个实验组:空白对照组(control,Con)、高糖损伤模型组(high glucose injury group,HG)、TFCSL给药组(200、400、600、800、1 000 μg/mL)和阳性对照组(25 μg/mL Vc),同样使用CCK-8检测细胞活力,方法同“1.5.2.1项”。

1.5.2.3 氧化应激生化指标检测

实验分Con组、HG组,不同批次TFCSL组和Vc组。每组设置3个复孔。收集细胞,加入PBS超声充分裂解后,离心取上清,按照试剂盒说明书分别测定MDA含量、LDH含量和SOD活力。

1.5.2.4 统计学处理

1.5.3 谱-效关系研究

1.5.3.1 灰色关联度分析

采用初值化变换法对原始数据进行无量纲化处理。将体外细胞实验各药效指标作为比较序列{X0(t)},各共有峰峰面积作为参考序列{Xi(t)},根据文献[14]计算得到各组关联度r。

1.5.3.2 偏最小二乘法

将标准化处理的不同批次共有峰峰面积数据设为自变量Y,各样品抗氧化药效指标作为因变量X,通过SIMCA-P 14.1软件进行数据处理,得到变量投影重要性系数(variable importance in projection,VIP)值。

1.5.4 网络药理学研究

根据谱-效分析结果,筛选出关键活性成分,利用中药系统药理学技术平台TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)对芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸C、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷相关蛋白靶点进行检索。使用“Oxidative Stress”作为关键词,分别在Gene cards(https://www.genecards.org/)数据库和OMIM(https://omim.org/)获得氧化应激人类基因相关靶点,其中Gene Cards数据库获取的疾病相关靶点根据基因靶点数量取其中位数处理,获取适当数量相关性高的靶点。将疾病靶点与活性成分的作用靶点取交集,即TFCSL抗氧化应激的靶点,将以上活性成分及治疗靶点交集数据导入Cytoscape 3.10.0软件,构建“药物-活性成分-关键靶点基因”网络。将交集基因导入到STRING数据库(https://string-db.org)进行分析,其结果导入Cytoscape 3.10.0软件,获得蛋白质-蛋白质相互作用PPI网络图,并进行核心靶点拓扑分析。将核心作用靶点在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行基因本体论GO和KEGG富集分析。

1.5.5 分子对接

PubChem数据库得到化学成分的3D结构信息,PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载靶蛋白的3D结构,使用Discovery Studio 2019软件对靶蛋白进行去除水分子,删除原配体,添加氢键等前处理操作,根据PDB晶体的原配体的空间位置定义活性口袋,运行精准分子对接(CDOCKER)模拟活性成分与蛋白对接。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验

取同一批次(编号:S12)制备供试品溶液,按“1.5.1.2”项下色谱条件,重复进样6次,计算其相对保留时间RSD为0.017%～1.4%,相对峰面积RSD为0.15%～1.3%,结果表明仪器精密度良好。

2.1.2 稳定性试验

取同一批次(编号:S12)制备供试品溶液,分别在0、2、4、6、12、24 h,按“1.5.1.2”项下色谱条件进行测定,对主要色谱共有峰进行分析,计算其相对保留时间RSD为0.051%～1.7%,相对峰面积RSD为0.13%～1.2%。表明样品溶液在24 h内相对稳定。

2.1.3 重复性试验

取同一批次(编号:S12)的样品6份,按“1.5.1.1”项方法制备供试品溶液,按“1.5.1.2”项下色谱条件进行测定,计算得到各共有峰相对保留时间RSD为0.041%～2.0%,相对峰面积RSD为0.17%～2.9%,表明该方法重复性良好。

2.2 指纹图谱的建立及相似度评价

2.2.1 指纹图谱的建立及共有峰标定

将12批次TFCSL样品按“1.5.1.1”项下方法制得供试品溶液,按照“1.5.1.2”项下的色谱条件进样测定。将各批次TFCSL HPLC 图谱数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”,设定(S8)为参照图谱,采用中位数法,时间窗的宽度默认为0.1 min,经过多点校正后将色谱峰自动匹配,生成12批TFCSL HPLC指纹图谱见图1。

图1 12批次TFCSL的HPLC指纹图谱Fig.1 Fingerprint of 12 batches of TFCSL

通过对照品色谱图(见图2)指认,共标定12个共有峰,确定其中的9个成分(见图3),分别是芦丁(1号峰)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2号峰)、异绿原酸B(3号峰)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5号峰)、异绿原酸C(6号峰)、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(7号峰)、芹菜素(10号峰)、香叶木素(11号峰)、异鼠李素(12号峰)。

图2 混合对照品溶液HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance

图3 TFCSL HPLC指纹图谱共有峰Fig.3 Common peaks in HPLC fingerprint of TFCSL

2.2.2 相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件”对12批TFCSL样品的指纹图谱进行相似度分析,结果见表1。12批样品相似度在0.951～0.998,表明相似度良好,各批次样品化学成分组成较一致。其中8号峰分离度好,峰形良好,含量稳定,故将其作为参照峰(S),计算得到各批次菊花样品指纹图谱共有峰的相对保留时间的RSD值为0.052%～0.72%,说明各批次样品化学成分组成差异较小。

表1 TFCSL样品HPLC指纹图谱相似度评价结果

2.3 菊茎叶总黄酮对高糖诱导HUVEC细胞氧化应激模型的影响

2.3.1 氧化应激模型的建立

不同浓度葡萄糖作用于HUVEC后,与空白组相比,当浓度为10 mmol/L时,细胞即出现活力明显下降(P<0.01),如图4所示。采用GraphPad prism软件做拟合曲线图,计算IC50值为50.4 mmol/L。这提示50.4 mmol/L葡萄糖能引起HUVEC适度损伤,后续实验将选取50 mmol/L作为高糖诱导HUVEC损伤的工作浓度。

图4 葡萄糖对HUVEC活力的影响Fig.4 Effect of glucose on the activity of HUVEC

2.3.2 不同浓度菊茎叶总黄酮对高糖下HUVEC的影响

如图5所示,TFCSL对高糖诱导HUVEC氧化损伤均具有保护作用,且呈质量浓度依赖性,其中TFCSL质量浓度为1 000 μg/mL时对HUVEC细胞氧化损伤保护效果最好,与阳性药Vc相当。

图5 TFCSL对氧化损伤HUVEC活力的影响Fig.5 Effect of TFCSL on the activity of oxidative damaged HUVEC

2.3.3 菊茎叶总黄酮调节HUVEC内MDA、LDH、SOD水平

如图6所示,HG组细胞内MDA、LDH含量较空白对照组分别显著升高至5.636 nmol/mL、85.61 U/gprot,SOD活力分别明显下降至6.659 U/gprot,表明高糖引起细胞氧化损伤并导致胞内LDH释放含量增加,MDA水平过高,SOD活性减弱。经TFCSL处理后,能有效降低高糖诱导的MDA、LDH水平增加,同时能明显改善SOD水平降低,具有统计学差异(P<0.01)。

图6 TFCSL对损伤HUVEC中MDA、LDH、SOD的影响Fig.6 The effect of TFCSL on MDA,LDH,and SOD in damaged HUVEC

2.4 谱效关系研究

2.4.1 灰色关联度分析

由表2可知,12个共有峰与抗氧化应激活性关联度均大于0.6,当关联度r>0.6时,表示成分与药效有关联性,r越大,成分与药效的关联性越强[15]。12个峰关联度都较高,说明TFCSL的抗氧化作用是不同化学成分协同作用的结果。由表2可知,与抑制LDH产生关联度大于0.9的峰有4个,其关联度大小依次为峰6(异绿原酸C)>峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰2(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷);对于抑制高糖诱导MDA产生,其中峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(异绿原酸C)等贡献较大;与SOD活性关联度均大于0.9的峰有3个,其大小依次为峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰6(异绿原酸C)>峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷),对增强氧化损伤细胞的SOD活性贡献较大。综合考虑各指标与TFCSL中各共有峰的关联度,发现其中存在共有药效成分,即峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(异绿原酸C)、峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷),这些共有药效成分是TFCSL发挥抗氧化应激作用的物质基础。

表2 MDA、LDH、SOD与各特征峰峰面积的关联度

2.4.2 偏最小二乘回归法

偏最小二乘回归法(partial least squares regression,PLSR)主要通过建立线性多元模型,以揭示因变量与自变量之间的相关性[16]。VIP值是反映自变量对因变量解释能力的一个重要指标,其值越大说明该自变量对因变量的解释能力越强,即相应色谱峰对应的化合物对药效的影响越强[17]。一般认为当VIP>1时,自变量在解释因变量时具有显著重要性[18]。分析结果如图7,峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰1(芦丁)、峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰11(香叶木素)、峰2(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)共5个共有峰的VIP值>1,表明这些成分对LDH抑制率的贡献度最大;峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰3(异绿原酸B)、峰6(异绿原酸C)、峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)共4个峰对抑制MDA水平的贡献度最大;峰11(香叶木素)、峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)等3个共有峰对增加SOD活性的贡献度最大。

图7 TFCSL指纹图谱与LDH、MDA、SOD VIP值Fig.7 Fingerprint of TFCSL and VIP value of LDH,MDA,SOD

2.5 网络药理学分析

根据谱效分析结果,筛选出关键化合物,共得到芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸C和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷共105个相关靶点基因,去重后得到77个。分别将从GeneCards和OMIM两个数据库中检索“氧化应激”相关靶点,并将相关靶点进行合并去重后最终获得氧化应激相关基因共1790个。将TFCSL活性成分对应靶基因取交集,共获得33个共同靶点,两者共同的基因可能是TFCSL抗氧化的潜在作用基因。将成分、共同靶点导入Cytoscape 3.10.0软件,剔除与共同靶点无作用关系的成分,构建“中药-成分-靶点”网络图(见图8)。

图8 TFCSL“中药-成分-靶点”图Fig.8 TFCSL "traditional Chinese medicine-component-target"

PPI网络分析能够了解基因间的关系,确定分子间的关联性。通过STRING数据库对交集靶点进行PPI分析,隐藏游离点基因后,共包含33个节点,153条边(见图9),按度值大小进行分类排序,TNF、CASP3是度值较高的靶点,认为是TFCSL抗氧化的关键作用靶点。

图9 TFCSL抗氧化应激PPI网络分析图Fig.9 PPI network analysis of antioxidant stress of TFCSL

利用DAVID数据库对获得的核心靶点进行 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析(见图10)。选取智人(Homo Sapiens)物种的“Gene Ontology”项,得到包含生物过程(biological process,BP)141个条目,主要涉及凋亡过程正调控、信号转导、对脂多糖的反应蛋白磷酸化等方面;细胞组成(cellular component,CC)23个条目,主要涉及细胞外间隙、细胞质基质、细胞质膜、细胞质、核质等方面。分子功能(molecular function,MF)35个条目,主要涉及蛋白质结合、相同蛋白结合、ATP结合、酶结合、内肽酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等方面。KEGG通路富集分析通过微生信进行可视化,这些通路主要富集在脂质和动脉粥样硬化信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、TNF通路、MPKA通路等。

图10 GO生物功能、KEGG通路富集图Fig.10 GO biological function and KEGG pathway enrichment map

2.6 分子对接

将通过谱-效关系筛选到的活性成分(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸C、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷),与网络药理学选出的TFCSL抗氧化应激的关键作用靶点(TNF、CASP3)进行分子对接,以揭示活性成分与TNF(PDB编号1A8M)、CASP3(PDB编号1CP3)之间的相互作用和亲和力,初步推断TFCSL抗氧化应激机制。一般用结合能来评估成分与靶点的结合能力,大于0表明可以自由结合,结合能越高表明受体与配体之间的亲和力越大,二者发生相互作用的可能性就越高[19]。三种化合物与各蛋白对接的结合能如表3所示。

表3 TFCSL活性成分与关键靶点的结合能

以TNF为例,配体(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸C和香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)与对接的二维和三维图如图11～13所示。结果表明,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷与氨基酸残基LEU57、SER9具有氢键作用,与LYS11产生盐桥作用,与PRO12、ALA156、ASP10、LYS11产生范德华作用,与LYS11形成碳氢键。异绿原酸C与ASP10、SER52、LYS11具有氢键作用,与LEU157、SER9、LEU55、GLY54、LYS11产生范德华力,与PRO12形成碳氢键,与LYS11产生盐桥作用,其母核主要与氨基酸残基ALA156、PRO12、LYS11形成疏水结合Pi-Alkyl作用。香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷与ASP10、LYS11、ALA156、LEU157、SER9、GLY54、GLU53、PRO12产生范德华力,与LEU157、SER9、ASP10、LYS11具有氢键作用,与SER9形成碳氢键,黄酮母核中的苯环参与π-阳离子、π-阴离子、π-Sigma、π-烷基等相互作用力的形成。这些相互作用力分别使芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异绿原酸C、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷与TNF结合并产生抑制作用。同理,这些作用力使各活性成分与CASP3靶点蛋白结合并产生抑制作用。

图11 化合物与TNF对接的2D和3D图Fig.11 2D and 3D diagrams of the docking of compounds with TNF

3 讨论与结论

本研究建立12批TFCSL样品 HPLC 指纹图谱,确定12个共有峰,并通过标准品对其中9个峰进行指认。高糖环境下可导致HUVEC受损和生理因子分泌紊乱,具体表现为促进细胞凋亡,上清液中LDH、MDA含量显著增高,SOD活性显著降低。经TFCSL处理后除可明显抑制细胞凋亡外,还可以改善氧化应激相关因子水平,保护HUVEC正常生理功能。利用灰色关联度分析法和偏最小二乘回归法分析各共有峰与抗氧化活性之间的相关性,推测峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(异绿原酸C)、峰7(香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)为TFCSL抗氧化应激的物质基础。

对谱-效相关分析所得的3种成分与抗氧化应激作用进行网络药理学分析,构建活性成分-靶点网络,筛选出TNF、CASP3可能为关键靶点,KEGG富集分析表示菊花茎叶总黄酮抗氧化可能与TNF通路、MPKA通路、IL-17信号通路等相关。GO富集分析可能通过蛋白激酶活性、ATP结合、酶结合等分子功能,以及信号传导和调控细胞生物过程发挥抗氧化应激作用。TNF是重要促炎因子之一,其中TNF-α可以刺激血管扩张增加血管内皮细胞通透性,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷可通过抑制MAPK通路缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎,调节TNF-α表达[20];现代药理研究表明异绿原酸C可降低巨噬细胞中TNF-α的表达及转录[21];CASP除了在凋亡过程中起重要作用外,也促进促炎细胞因子的产生,香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷对去血清条件下血管内皮细胞有保护作用,降低细胞内ROS水平,下调CASP3水平[22]。

通过对Discovery Studio软件分子对接结果的分析比较,发现TFCSL中3个主要活性成分与TNF、CASP3具有较为稳定的结合活性。通过进一步筛选对接结果,发现3种成分与TNF、CASP3蛋白作用残基大部分都是相同的,其中与受体相互作用种类多且作用较强的共同残基主要有:SER9、LYS11、PRO12、ALA156、ASP10、LYS11,推断它们可能为受体的活性位点残基。

我国菊资源分布广泛,但目前对菊花的开发利用存在着不足,其他非用药部位如根、茎、叶等中研究报道相对较少。菊非药用部位的化学成分与菊花极其相似,具有显著的生物学活性,但由于缺乏深入研究,导致这些有效成分未得到合理的利用与开发。本研究对TFCSL抗氧化应激活性进行初步的研究与探讨,后续增加对未明确的共有峰进行结构解析,并结合药理实验对其功能进一步开发,以期为菊茎叶的开发利用与产业化方向提供科学依据和参考。