UPLC-MS/MS同时测定麦冬配方颗粒中4个成分的含量及山麦冬成分的检查△

刘斌，张力伟，王煦辰，孔令红，赵海燕，周海燕，丁富娟

1.泰安市食品药品检验检测研究院，山东 泰安 271000；

2.泰安市岱岳区疾病预防控制中心，山东 泰安 271000

麦冬配方颗粒是由百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥块根经炮制并按照标准汤剂的质量标准加工制成的配方颗粒，具有养阴生津、润肺清心的功效，适用于肺燥干咳、津伤口渴、肠燥便秘等症状[1]。目前，麦冬配方颗粒的国家药品标准和各企业标准中含量测定均采用紫外-可见分光光度法检测，以鲁斯可皂苷元代表麦冬总皂苷的含量，样品处理步骤繁琐、重复性差、准确度低、质量控制不够全面。山麦冬（湖北麦冬或短葶山麦冬）与麦冬性状相似，容易混淆，市售麦冬中混入山麦冬的情况时有发生，但现行的质量标准缺乏有效的检查方法，无法对麦冬中混有山麦冬进行有效的质量控制[2-9]。本研究结合相关研究[10-19]，采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法（UPLCMS/MS），同时测定麦冬配方颗粒中麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B 4个成分的含量并聚类分析，可以较为快速、全面地评价麦冬配方颗粒的质量，并对山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 这2 个山麦冬的专属性成分进行检测，以检查麦冬配方颗粒生产用麦冬中是否混有湖北麦冬和短葶山麦冬，为其质量控制提供了一些科学依据。

1 材料

1.1 样品

26 批麦冬（川麦冬）配方颗粒均为市售样品，详细信息见表1。麦冬（川麦冬）、山麦冬（湖北麦冬）、山麦冬（短葶山麦冬）购自安徽亳州中药材市场，经泰安市食品药品检验检测研究院王海燕主任中药师鉴别为正品。

1.2 试药

对照品山麦冬皂苷B（批号：111907-201804，纯度：100%）、短葶山麦冬皂苷C（批号：111908-202303，纯度：100%）均购自中国食品药品检定研究院；麦冬皂苷C（批号：PS020821，纯度：98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；麦冬皂苷D（批号：MUST-22051503，纯度：98.72%）、麦冬甲基黄烷酮A（批号：MUST22042305，纯度：98.42%）、麦冬甲基黄烷酮 B（批号：MUST22032304，纯度：99.77%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、甲酸为质谱纯；水为超纯水；甲醇为色谱纯。

1.3 仪器

Vanquish UHPLC 型超高效液相色谱仪、TSQ Quantis Plus 型三重四极杆质谱仪均购于美国赛默飞世尔公司；XS205 DU 型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和质谱条件

Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.5 min，20%A；0.5～10.0 min，20%～90%A；10.0～14.0 min，90%A）；流速为0.2 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样量为2 μL。离子源采用电喷雾离子源（ESI）；离子化电压：正离子3.5 kV，负离子2.5 kV；离子源温度为350 ℃ ；喷雾气压力为3.5×105Pa；辅助加热气压力为1.0×105Pa；碰撞气为氮气；扫描模式采用多反应监测模式（MRM），质谱参数见表2。

表2 麦冬样品检测质谱参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液和混合对照品溶液的制备精密称取麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C 对照品适量，分别加甲醇制成质量浓度为203.6、204.6、226.6、195.6、211.2、202.6 μg·mL-1对照品储备溶液。再分别精密量取对照品储备溶液1 mL，置于同一20 mL 量瓶中，加甲醇制成麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C质量浓度分别为10.2、10.2、11.3、9.8、10.6、10.1 μg·mL-1的混合对照品溶液。色谱图见图1、图2。

图1 混合对照品和麦冬配方颗粒样品的MRM离子流色谱图（叠加图）

图2 6个对照品定量与定性离子对叠加图

2.2.2 供试品溶液的制备 取麦冬配方颗粒，研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率50 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。色谱图见图1。

2.2.3 对照药材溶液的制备 根据麦冬配方颗粒的制备工艺，分别取麦冬（川麦冬）、山麦冬（湖北麦冬）及山麦冬（短葶山麦冬）各1.1 g，加水100 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液减压浓缩至干，残渣按2.2.2 项下方法“置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL”起，同法制成麦冬（川麦冬）、山麦冬（湖北麦冬）和山麦冬（短葶山麦冬）的对照药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取2.2.1 项下的混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分别置100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成不同质量浓度的标准溶液，在2.1 项下条件测定。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表3，6 个成分r≥0.995，表明在线性范围内线性良好。

表3 6个待测成分的线性回归方程、线性范围、检测限和定量限

2.3.2 检测限和定量限 精密量取2.2.1 项下的最低质量浓度混合对照品溶液，加甲醇稀释至不同质量浓度，摇匀，按2.1 项下条件测定，以各化合物峰信噪比（S/N）为3 和10 分别作为检测限和定量限，结果见表3。

2.3.3 专属性试验 分别取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液，按2.1 项下条件进样测定。供试品溶液和麦冬（川麦冬）对照药材溶液中的麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 与混合对照品溶液中的离子峰一致，且无与山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C一致的离子峰，山麦冬（湖北麦冬）对照药材溶液中的山麦冬皂苷B 与混合对照品溶液中的离子峰一致，山麦冬（短葶山麦冬）对照药材溶液中的短葶山麦冬皂苷C 与混合对照品溶液中的离子峰一致，阳性供试品溶液检出与混合对照品溶液中山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C一致的离子峰，结果见图3。由此可以判断，山麦冬皂苷B为山麦冬（湖北麦冬）的专属性成分，短葶山麦冬皂苷C为山麦冬（短葶山麦冬）的专属性成分，可以通过检测山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 来准确判定麦冬配方颗粒中是否含有山麦冬（湖北麦冬）和山麦冬（短葶山麦冬）。

2.3.4 精密度试验 精密量取2.2.1 项下的混合对照品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，在2.1项下条件测定，重复测定6次，结果麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 峰面积的RSD 分别为1.19%、1.32%、0.92%、0.73%、1.58%、1.79%，表明仪器的精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取麦冬配方颗粒（S1），按2.2.2 项下方法制备，分别于0、4、8、12、16、20、24 h，按2.1 项下条件测定，结果麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C峰面积的RSD分别为1.51%、1.68%、1.40%、1.78%、1.60%、1.43%，表明6个成分在溶液中24 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 取麦冬配方颗粒（S1），按2.2.2 项下方法平行制备6 份，按2.1 项下条件测定，分别计算麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C 的含量，结果6 个成分平均质量分数分别为14.1、24.4、14.7、8.7、22.4、3.2 μg·g-1，含量的RSD分别为2.02%、1.91%、1.52%、1.85%、1.70%和1.33%，表明方法的重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取已知含量的麦冬配方颗粒（S1）0.5 g，精密称定，平行称取6 份，分别精密加入2.2.1 项下的混合对照品溶液1 mL，按2.2.2 项下方法制备，按2.1 项下条件测定，计算麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B 和短葶山麦冬皂苷C 的平均加样回收率，见表4。

表4 麦冬配方颗粒6个成分的加样回收试验结果

2.3.8 含量测定 分别取26 批麦冬配方颗粒，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件测定，计算各批次样品中麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的含量，结果见表5。麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 的质量分数分别为6.4～17.3、15.1～29.1、9.0～22.6、4.5～14.4 μg·g-1，不同批次间4 个成分的含量有一定差异，因样品检测均执行企业标准，其规格（每1 g 配方颗粒相当于饮片）有1.10、1.11、1.20、3.30、3.33 g·g-15 种，分析差异可能与麦冬原料药材和规格不同有关。以仪器的定量限换算设定麦冬配方颗粒中山麦冬皂苷B 的限度为0.29 μg·g-1、短葶山麦冬皂苷C的限度为0.10 μg·g-1，有3 批次样品中检出山麦冬皂苷B，其中2 批同时检出短葶山麦冬皂苷C，表明原料中混入了湖北麦冬、短葶山麦冬。

2.4 聚类分析

以麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 4 个共有成分为变量，运用SPSS 24.0 软件，以平方欧氏距离为测度对26 批麦冬配方颗粒进行聚类分析，结果见图4。由图4可知，当类间距为15、10 和5 时，26 批样品聚类数目分别为2、4、8类。当类间距为5时，广东一方制药有限公司、青州尧王制药有限公司的样品分别聚为一类；当类间距为15 时，江阴天江药业有限公司、山东一方制药有限公司、华润三九医药股份有限公司的样品分别聚为一类。由此可见，不同批次间4 个成分的含量和总量存在差异，不同厂家样品间的差异较大，表明麦冬配方颗粒的质量有一定差异，分析可能与麦冬原料和生产工艺有关，也可能与质量控制标准中规格不一致有关，北京康仁堂药业有限公司的2批次间差异亦较大，其S1 样品检出山麦冬成分，分析主要与麦冬原料质量有关。

图4 26批麦冬配方颗粒的聚类分析

3 讨论

3.1 提取方式的选择

本研究分别考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作为提取溶剂，分别采取超声（15、30、60 min）或加热回流（30、60、90 min）提取麦冬配方颗粒样品，取续滤液作为供试品溶液，按2.1 项下条件测定。结果显示，采用50%甲醇为提取溶剂时各色谱峰峰形及响应值均较好，且超声提取30 min已提取完全，因此，采用50%甲醇超声30 min 作为提取方法。

3.2 质谱条件的优化

分别对麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B、山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C 6 个成分进行了正、负离子模式扫描，结果显示山麦冬皂苷B 在正离子检测模式下的响应较强，且稳定性较高，因此，选用正离子模式检测；其他5 个成分在负离子检测模式下响应较强，因此，选用负离子模式检测麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 和短葶山麦冬皂苷C。采用MRM 扫描，通过对子离子的射频电压和碰撞能量进行优化，分别选择丰度高的子离子作为定量离子。

3.3 色谱条件的选择

分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，发现0.1%甲酸水溶液离子化效果更好，乙腈比甲醇分离效果更好，因此，选用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相，并采用梯度洗脱方式优化，使色谱峰分离效果更好、峰形较好，且出峰时间与柱平衡时间较短，提高了实验效率。采用优化的色谱条件，分别使用赛默飞世尔TSQ Quantis Plus和岛津LCMS8050 两种液相色谱-质谱联用仪，Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）、Shimadzu Shim-pack Velox C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）、Waters Acquity UPLCHSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 µm）3种色谱柱考察6个成分的分离效果，结果均较好。

3.4 结果分析

本研究通过对26批麦冬配方颗粒中麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 4 个成分进行含量测定和聚类分析后发现，5 个厂家中同厂家样品之间4 个成分含量和总量的差异较小，不同厂家样品间4 个成分的含量和总量的差异较大，说明不同厂家对于原料的质量和生产的控制还缺少统一的标准。通过对26 批麦冬配方颗粒检查发现有3 批次样品检出山麦冬皂苷B，其中2 批同时检出短葶山麦冬皂苷C，说明其生产使用的麦冬原料中存在混入湖北麦冬、短葶山麦冬的情况，需要提高麦冬的检验标准并加强对原料的质量控制。

4 结论

本研究建立了UPLC-MS/MS 同时测定麦冬配方颗粒中麦冬皂苷C、麦冬皂苷D、麦冬甲基黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮B 4 个成分的含量，并通过测定山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C 来检查是否混有山麦冬的方法，该方法样品处理快速、简单，检测灵敏度高，准确度好，可用于评价和控制麦冬配方颗粒的质量，同时用于检查麦冬原料是否混入山麦冬，为麦冬配方颗粒的质量控制提供可靠的分析方法和参考依据。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。