高效液相色谱法—蒸发光检测器测定复方石韦片中黄芪甲苷的含量

段树卿,李秀玲,孙利,李云霞

复方石韦片由黄芪、石韦、苦参、萹蓄4味中药材组成,处方来源于《证治汇补》中的石韦散[1]。药效学试验表明,复方石韦片具有利尿、抗菌、抗感染、解痉作用[2-3]。临床试验表明,复方石韦片具有清热利湿、利尿通淋的功效,对上下尿路感染疗效确切,临床使用安全[4-5]。复方石韦片现行质量标准收载于《中国药典》[6],含量测定项下规定对黄芪中的黄芪甲苷进行检测,黄芪甲苷一部分为游离黄芪甲苷,一部分为碱性条件下黄芪甲苷衍生物的转化,其总和才是复方石韦片中黄芪甲苷的总含量[7-9]。因此,黄芪甲苷含量测定的结果与化学反应过程中其衍生物转化的程度直接相关,复方石韦片供试品的制备方法是黄芪甲苷测定的关键。回流碱化衍生法具有碱性、强碱化温度高和碱化时间长的特点,预测此法可将黄芪甲苷衍生物完全转化为黄芪甲苷[10-12]。本研究在《中华人民共和国药典2020年版(一部)》[6](以下简称《中国药典》)方法基础上采用回流碱化衍生法建立复方石韦片中黄芪甲苷含量测定方法,以期提供一种更准确、简便、高效的黄芪甲苷含量测定方法,同时为复方石韦片的质量标准后续研究提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器及试剂 Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色谱仪(蒸发光检测器,Aglient);DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(泰斯特);XSE205DU十万分之一电子分析天平(梅特勒—托利多)。乙腈(色谱纯,美国Merck公司);甲醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);正丁醇(分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);水为三级返渗超纯水。

1.2 试药 黄芪甲苷对照品(批号：110781-202118,浓度：96.8%),购于中国食品药品检定研究院;复方石韦片(批号：730391、830223、830040、830225、030470、030443、030471、030475、030574、030045、030469、030473、130030、130023、130066、130068)为颈复康药业集团有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent 5-HC C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙睛—水(34∶66),流速1.0 ml/min,柱温30 ℃,进样量20 μl;蒸发光检测器参数：载气流速1.6 L/min,漂移管温度100 ℃,理论板数按照黄芪甲苷色谱峰计算应≥4 000。

2.2 样品

2.2.1 对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量,用甲醇作为溶解剂进行溶解,制成每1 ml含黄芪甲苷对照品200 μg的溶液,作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备：取复方石韦片样品适量,除去包衣,研磨成细粉,精密称定2 g,放置于100 ml具塞锥形瓶中,精密加入含0.2%氢氧化钠溶液的80%甲醇溶液50 ml, 密塞,称重,加热回流1 h,放冷,再次称重,用含0.2%氢氧化钠溶液的80%甲醇溶液补重,摇匀,滤过,移液管精密吸取续滤液25 ml,水浴蒸干,残渣加20 ml的水溶解,再用水饱和的正丁醇萃取4次,每次20 ml,合并正丁醇萃取液,再次蒸干,残渣用适量的甲醇充分溶解,移至5 ml的容量瓶中,用甲醇溶液定容至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜过滤,即为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备：取复方石韦片组方中其他三味中药按比例及工艺制备样品,按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备成不含黄芪的阴性样品溶液。

2.3 空白试验 按照“2.1”项下色谱条件,分别精密吸取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下的对照品、供试品、阴性样品溶液,进行色谱分析检测,图谱结果显示,在此色谱条件下,黄芪甲苷峰形对称,与相邻色谱峰分离良好,阴性样品对样品检测无干扰,见图1。

A.对照品色谱图

2.4 线性关系 取黄芪甲苷对照品适量,加甲醇制成2.043 mg/ml的对照品溶液。采用倍比稀释法加甲醇分别制成1.021 5、0.510 75、0.204 3、0.051 07、0.020 43 mg/ml对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样20 μl,以对照品峰面积的对数值为横坐标(X),以对照品进样质量的对数值为纵坐标(Y)进行线性回归分析并制作标准曲线,得出线性回归方程为Y=0.788 6X-4.920 1,r=0.999 6。结果表明,黄芪甲苷在0.020 43～2.043 mg/ml范围内,黄芪甲苷峰面积与黄芪甲苷进样质量的对数值呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验 取适量的复方石韦片样品,按照上述方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件,分别于0、2、4、6、8、10、12 h时进样分析测定,记录图谱并计算RSD值。结果显示,黄芪甲苷峰面积的RSD值为2.7%,提示复方石韦片供试品溶液在12 h内能保持稳定。

2.6 重复性试验 取适量同批次复方石韦片样品(批号：730391),按照上述方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件,记录图谱,计算样品中黄芪甲苷含量及RSD值。结果显示,本批复方石韦片黄芪甲苷的平均含量为704.8 μg/g,RSD值为1.7%,提示该方法重复性良好。

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下黄芪甲苷(0.202 4 mg/ml)对照品溶液,按照上述方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件,记录图谱并计算RSD值。结果显示,黄芪甲苷峰面积的RSD值为1.2%,提示仪器精密度符合要求。

2.8 加样回收试验 称取9份已知含量的复方石韦片样品(批号：730391),均分为3组,分别加入3组不同浓度的黄芪甲苷对照品溶液,按照上述方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件,记录图谱,计算加样回收率及RSD值,结果显示,黄芪甲苷的平均加样回收率为97.3%,RSD值为2.4%,回收率良好,见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 检测限 取标准曲线试验工作液中最低浓度的对照品溶液稀释,按上述色谱条件进样,然后按倍数稀释对照品溶液,测得信噪比为3∶1时,黄芪甲苷对照品溶液浓度为0.002 553 5 mg/ml,确定检测限为0.051 07 μg。

2.10 定量限 取标准曲线试验工作液中最低浓度的对照品溶液稀释,按上述色谱条件进样,然后按倍数稀释对照品溶液,测得信噪比为10∶1时,黄芪甲苷对照品溶液浓度为0.001 02 mg/ml,确定定量限为0.020 43 μg。

2.11 样品测定 取待测的16批复方石韦片样品,按照上述方法制备供试品溶液,并按照上述色谱条件,按《中国药典》[6]复方石韦片项下黄芪甲苷含量测定方法检测,分别计算样品含量。结果,采用回流碱化衍生法测得的16批复方石韦片样品中黄芪甲苷含量为0.60～0.98 mg/g,平均值0.75 mg/g,采用药典方法测得的16批复方石韦片样品中黄芪甲苷含量为0.55～0.93 mg/g,平均值0.67 mg/g,同批次复方石韦片样品采用回流衍生法的含量测定结果均略高于采用药典方法的含量测定结果,见表2。

表2 复方石韦片样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化 参照相关文献[13-15],考察不同的流动相体系及不同的流动相比例(乙腈—水、甲醇—水、乙腈—0.2%甲酸水溶液、甲醇—0.2%甲酸水溶液),经比较采用结果显示选用乙腈—水(34∶66)等度洗脱时,基线平稳,黄芪甲苷分离效果好。同时考察了不同的漂移管温度(80、90、100 ℃)和不同的载气体积流量(1.6、2.0、2.6 L/min),结果当漂移管温度100 ℃,载气体积流量1.6 L/min时,待测色谱峰达到基线分离,色谱图较理想。

3.2 采用不同提取溶剂进行比较 参照相关文献[16-20],本研究考察了不同提取液：80%甲醇溶液(含4%浓氨试液)、80%甲醇溶液(含10%浓氨试液)、80%甲醇溶液(含0.1%氢氧化钠溶液)、80%甲醇溶液(含0.2%氢氧化钠溶液)、80%甲醇溶液(含0.4%氢氧化钠溶液),结果显示采用80%甲醇溶液(含0.2%氢氧化钠溶液)提取液可以把样品提取完全。

3.3 采用不同量的提取溶剂进行比较 本研究考察了不同提取液(含0.2%氢氧化钠溶液的80%甲醇溶液)体积：25、50、100 ml,结果显示提取液体积为50 ml与100 ml时测得样品黄芪甲苷含量无明显差别,且均高于提取液体积为25 ml时,说明加入50 ml的提取液已把样品提取完全。

3.4 采用不同提取时间进行比较 本研究考察了不同加热回流时间：30、60、90 min,结果显示加热回流60 min与90 min时测得样品黄芪甲苷含量无明显差别,且均高于加热回流30 min,说明提取时间为60 min时已把样品提取完全。

综上所述,本研究以药典法测定复方石韦片中黄芪甲苷的原理为基础, 采用回流碱化衍生法建立的方法操作更加简便、结果稳定、黄芪甲苷衍生物转化效率高、可重复性好,可用于测定复方石韦片中黄芪甲苷的含量,同时也为其他含黄芪制剂的质量控制提供参考。

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