雷公藤甲素对肺动脉高压大鼠免疫炎症的影响及其作用机制

王梅爱 黄秋虹 陈慧勤 黄倩 郑丹丹 （泉州医学高等专科学校基础医学部，泉州 362000）

肺动脉高压是较常见且严重的血管性疾病，特点为肺动脉压力、肺血管循环阻力升高，以动脉型肺动脉高压亚型研究最为广泛，病因为肺小动脉原发性病变、肺小动脉血管重塑增厚而致肺动脉阻力增加，可累及心脏，最终引起右心衰竭或死亡［1］。临床研究发现，肺动脉高压的发生与免疫炎症所介导的肺小动脉重塑相关，重塑的肺小动脉周围存在不同程度的淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润，上述炎症细胞分泌炎症因子，随着病程发展，最终导致肺动脉内皮损伤［2］。

野百合碱（monocrotaline，MCT）属吡咯烷生物碱，可引起肺动脉平滑肌细胞异常增殖、肺小动脉重塑，最终导致肺动脉高压发生［3］。目前利用MCT所致的肺动脉高压模型较为经典，可用于研究药物效果和作用机制。

目前临床上多采用波生坦、贝前列素等药物治疗肺动脉高压，虽能明显控制疾病进一步进展，但长期疗效不佳，严重影响患者的生命安全，因此，寻找治疗肺动脉高压的有效药物刻不容缓。雷公藤甲素属本质藤本植物雷公藤提取物，随着对雷公藤甲素的研究增多发现其具有免疫抑制、抗肿瘤、抗炎的药效，且可改变血管病变［4］。虽然早在2010年就有研究发现雷公藤甲素具有治疗肺动脉高压作用，但其具体作用机制尚未明确［5］。因此本文采用MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型，使用雷公藤甲素干预，分析其治疗肺动脉高压的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取6～8周龄SPF清洁级SD雄性大鼠90只，体质量190～240 g，均购自中国食品药品检定研究院，动物许可证号：SYXK（京）2021-0019。在恒温（22±2） ℃、恒湿（55±5）%、人工光照明暗各12 h环境下适应性饲养7 d，均自由活动、饮水、取食。本研究获得泉州医学高等专科学校伦理委员会批准［泉医高专动物伦理审字（2021013号）］。

1.1.2 试剂与仪器 MCT（TargetMol，中国）；雷公藤甲素（滁州仕诺达生物科技有限公司，规格20 mg，质量分数＞98%）；苏木精-伊红染液（上海吉至生化科技有限公司）；ELISA试剂盒及相关试剂（江西艾博因生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠TLR4抗体、兔抗人NF-κB抗体（深圳海思安生物技术有限公司）。光学显微镜（奥林巴斯）；流式细胞仪（美国BD）。

1.2 方法

1.2.1 肺动脉高压模型构建 随机选取15只大鼠作为正常组，其余75只大鼠作为肺动脉高压组，建立肺动脉高压模型，均一次性皮下注射60 mg/kg MCT，连续观察14 d，建模过程中肺动脉高压组共死亡5只。在建模第15天随机选取2组中的5只大鼠测定平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP），若与正常组相比，肺动脉高压组mPAP、RVSP均明显升高，且差异具有统计学意义则说明模型建立成功。

1.2.2 分组干预 分析mPAP、RVSP水平发现肺动脉高压组均建模成功，将剩余的65只大鼠随机分为模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组，每组13只。阳性对照组使用30 mg/kg泼生坦灌胃，雷公藤甲素A、B、C组根据文献［5］剂量给药，分别腹腔注射0.1、0.2、0.4 mg/kg雷公藤甲素，正常组、模型组注射等体积生理盐水。连续干预28 d，观察大鼠变化。

1.2.3 指标观察

1.2.3.1 mPAP、RVSP测定 在药物干预结束后次日，称量大鼠体质量，根据体质量腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，在其右颈部做一切口，将右侧颈外静脉分离，经上腔静脉、右心房将右心导管插至肺动脉，导管另一端连接压力传感器，智能生理信号采集、记录系统，当出现稳定的波形后测定mPAP、RVSP。

1.2.3.2 样本采集 在上述操作完成后，抽取6组大鼠腹主动脉血，备用。之后遵循动物实验伦理要求处死大鼠，迅速取心肺组织，心脏组织用于测定右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy index，RVHI），右肺制备石蜡切片，做肺小动脉形态、肺小动脉重塑分析，左肺首先进行肺泡灌洗，将得到的灌洗液保存，灌洗之后的左肺组织保存于液氮中备用。

1.2.3.3 RVHI测定 取各组所分离的心脏组织标本，沿室间隔（ventricular septum，S）将心室分离出后冲洗、吸干水分，对室间隔左心室（ventricular septum was left ventricle，LV）、右心室（right ventricle，RV）质量进行称量，计算RVHI，RVHI=RV/（LV+S）。

1.2.3.4 肺小动脉形态、肺小动脉重塑观察 取右肺石蜡切片样本，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察6组大鼠肺小动脉形态。同时测定肺小动脉重塑相关指标：肺小动脉中层血管壁厚度占肺小动脉外径的百分比（MT%）、肺小动脉中层横截面积占总横截面积的百分比（MA%）。

1.2.3.5 免疫炎症相关指标测定 取所采集的腹主动脉血，分离出淋巴细胞，进行细胞表面荧光染色，使用流式细胞仪测定Th17细胞、Treg细胞比例。取腹主动脉血、肺泡灌洗液，使用ELISA测定血清、肺泡灌洗液中Th17细胞相关因子IL-6，IL-17、Treg细胞因子IL-10表达水平。

1.2.3.6 TLR4/NF-κB信号通路蛋白测定 取液氮中保存的左肺组织，分离出肺动脉，肺动脉加入80 μl裂解缓冲液，提取蛋白，制备为匀浆，在4 ℃下离心15 min（12 000 g，r=5 cm），收集所分离的上清液，定量分析蛋白，并使蛋白变性、电泳，采用Western blot法测定TLR4/NF-κB信号通路蛋白TLR4、NF-κB蛋白表达量。

1.3 统计学分析 数据使用SPSS22.0软件分析，各组间差异比较使用单因素方差或双因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺动脉高压模型鉴定 建模过程中，正常组大鼠无死亡，活动自如。肺动脉高压组随着MCT注射时间延长，活动逐渐减少，呼吸困难，毛发粗糙，体质量增长缓慢，且症状逐渐加重，共死亡5只。在建模第14天测定mPAP、RVSP，肺动脉高压组mPAP、RVSP均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示肺动脉高压模型建立成功。见图1。

图1 正常组、肺动脉高压组mPAP、RVSP比较Fig.1 Comparison of mPAP and RVSP between normal group and pulmonary hypertension group

2.2 mPAP、RVSP对比 与正常组相比，模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP升高（P＜0.05）；阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP均低于模型组（P＜0.05）；雷公藤甲素A、B、C组mPAP、RVSP均低于阳性对照组（P＜0.05）；随着雷公藤甲素干预剂量的增加，mPAP、RVSP逐渐降低，雷公藤甲素C组低于B组、A组（P＜0.05）。见图2。

图2 各组mPAP、RVSP对比Fig.2 Comparison of mPAP and RVSP in each group

2.3 RVHI对比 与正常组相比，模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组RVHI升高（P＜0.05）；阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组RVHI均低于模型组（P＜0.05）；雷公藤甲素A、B、C组RVHI均低于阳性对照组（P＜0.05）；随着雷公藤甲素干预剂量的增加，RVHI逐渐降低，雷公藤甲素C组RVHI低于B组、A组（P＜0.05）。见图3。

图3 各组RVHI对比Fig.3 Comparison of RVHI in each group

2.4 肺小动脉形态观察 正常组大鼠肺小动脉管壁厚度一致，内皮细胞均匀紧贴于血管壁，无炎症浸润；相比于正常组，模型组管壁明显增厚，管腔狭窄，内皮细胞部分肿大脱落，有炎症浸润现象。相比于模型组，阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组病理改变均显著改善，且雷公藤甲素C组改善程度大于雷公藤甲素B组、A组、阳性对照组。见图4。

图4 肺小动脉形态苏木精-伊红染色（×400）Fig.4 Hematoxylin-eosin staining of pulmonary arteriole morphology （×400）

2.5 肺小动脉重塑指标水平对比 与正常组相比，模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组肺小动脉重塑指标MT%、MA%升高（P＜0.05）；阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组MT%、MA%均低于模型组（P＜0.05）；雷公藤甲素A、B、C组MT%、MA%均低于阳性对照组（P＜0.05）；随着雷公藤甲素干预剂量的增加，MT%、MA%逐渐降低，雷公藤甲素C组低于B组、A组（P＜0.05）。见图5。

2.6 免疫炎症相关指标水平对比 与正常组相比，模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平升高，Treg细胞比例、IL-10水平降低（P＜0.05）；阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平低于模型组，Treg细胞比例、IL-10水平高于模型组（P＜0.05）；雷公藤甲素A、B、C组Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平低于阳性对照组，Treg细胞比例、IL-10水平高于阳性对照组（P＜0.05）；随着雷公藤甲素干预剂量的增加，Th17细胞比例、IL-6、IL-17水平逐渐降低，雷公藤甲素C组低于B组、A组，Treg细胞比例、IL-10水平逐渐升高，雷公藤甲素C组高于B组、A组（P＜0.05）。见图6。

图6 免疫炎症相关指标水平对比Fig.6 Comparison of levels of immune inflammationrelated indicators

2.7 TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达量对比 与正常组相比，模型组、阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组TLR4、NF-κB升高（P＜0.05）；阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组TLR4、NF-κB均低于模型组（P＜0.05）；雷公藤甲素A、B、C组TLR4、NF-κB均低于阳性对照组（P＜0.05）；随着雷公藤甲素干预剂量的增加，TLR4、NF-κB逐渐降低，雷公藤甲素C组低于B组、A组（P＜0.05）。见图7。

图7 TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达量对比Fig.7 Comparison of proteins expressions of TLR4/NF-κB signaling pathway

3 讨论

肺动脉高压属恶性肺血管疾病，主要病理改变为肺血管重塑，而在此过程中免疫炎症发挥重要作用，因此多数学者致力于肺动脉高压免疫炎症的研究［6-7］。鉴于此，本文以免疫炎症为研究方向，分析药物干预对肺动脉高压大鼠免疫炎症的影响，并探究其具体作用机制，为临床上治疗肺动脉高压疾病提供参考。

临床研究认为，在肺动脉高压进展过程中可累及心脏，肺动脉-肺脏-右心室形成此病的发病轴，右心功能明显改变［8-10］。因此根据右心功能相关指标可评价疾病情况，本研究使用RVSP、RVHI分析各组右心功能，结果发现，模型验证时，肺动脉高压组RVSP、RVHI较正常组均显著升高，提示肺动脉高压已经累及心脏。雷公藤甲素属于一种炎症反应抑制剂，具有较强的抗免疫炎症的作用［11］。CHEN等［12］研究认为雷公藤甲素具有抑制深度低温循环停止大鼠炎症的作用。且部分研究证明，雷公藤甲素用于多种疾病的干预治疗效果理想［13-14］。在上述背景下本文将雷公藤甲素用于肺动脉高压的干预中，经药物干预后发现，阳性对照组、雷公藤甲素A、B、C组RVSP、RVHI均有一定程度降低，且以雷公藤甲素C组降低幅度最大，此结果提示雷公藤甲素可修复肺动脉高压累及的心脏病变。

本研究结果显示，使用雷公藤甲素干预后大鼠免疫炎症明显被抑制，表现为Th17/Treg细胞失衡被修复，且经雷公藤甲素干预的肺动脉高压大鼠TLR4/NF-κB信号通路蛋白TLR4、NF-κB蛋白表达量明显降低，此结果说明雷公藤甲素具有改善肺动脉高压大鼠免疫炎症表现的作用，且TLR4/NF-κB信号通路可能为其具体作用机制，此结果与孙贝贝等［15］、宗佳琪等［16］的研究结果相似，均认为TLR4/NF-κB信号通路为雷公藤甲素发挥作用的靶点。报道称，TLR4/NF-κB信号通路中的TLR4广泛分布于中性粒细胞、肺巨噬细胞、气道上皮细胞中的Toll样受体家族成员，TLR4与肺动脉高压关系密切，在肺动脉高压中表达异常升高［17-18］。研究显示，在肺组织受到外部因素刺激后，存在于肺血管内的TLR4与其对应的配体发生特异性结合，此时作为TLR4的下游转录子NF-κB被激活，NF-κB被激活后Th17/Treg失衡，进而诱导肺动脉高压的发生［19］。在肺动脉高压发生时，TLR4/NF-κB被激活，随着疾病的进展Th17细胞分泌IL-6、IL-17能力增强，Treg细胞所分泌的IL-10水平降低，其中IL-6、IL-17为促炎因子，可促进肺局部免疫炎症级联，抑炎因子IL-10低水平不足以维持Th17/Treg平衡，而导致肺小动脉重塑，最终导致疾病的发生发展［20-22］。本文发现雷公藤甲素经肺动脉高压大鼠TLR4/NF-κB信号通路蛋白TLR4、NF-κB蛋白纠正Th17/Treg细胞失衡表现，通过抑制免疫炎症反应而修复肺小动脉重塑，最终发挥治疗肺动脉高压的作用。

本研究认为，雷公藤甲素可剂量依赖地改善肺动脉高压，但仅分析对动脉型肺动脉高压的药效，并未分析雷公藤甲素对其他类型肺动脉高压的干预作用，还需进一步分析是否可用于其他类型的肺动脉高压干预治疗。

综上，本研究发现雷公藤甲素可剂量依赖地改善肺动脉高压大鼠肺动脉病理损伤，抑制肺小动脉重塑、免疫炎症，其机制可能与TLR4/NF-κB失活有关。综合以上结果可认为雷公藤甲素具有治疗肺动脉高压的潜力，值得进一步研究。