EGFR通路在动脉粥样硬化机制中的作用研究

涂艳虹 程波 （江汉大学附属医院武汉市第六医院综合科，武汉 430015）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为一种威胁人类健康的心血管疾病，是老年人最常见的死亡原因之一［1］。其主要病变特点为部分动脉脂质沉淀，伴有平滑肌细胞和纤维基质增生，逐渐发展为AS斑块形成。AS常被认为是一种慢性炎症性疾病［2］。炎症在AS病变过程中起重要作用，是AS发生和发展过程中生理和病理变化的共同基础［3］。来源于平滑肌细胞和巨噬细胞的泡沫细胞形成是AS的早期指标，也是AS发展的重要部分［4］。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是G蛋白偶联受体、类固醇受体和酪氨酸激酶的重要信号通路整合因子［5］。EGFR在许多细胞过程中起主要作用，对活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生和巨噬细胞炎症介质释放非常重要［6］。最近研究表明，EGFR参与血管病理生理学，尤其是巨噬细胞氧化应激调节［7］。EGFR也参与促炎症、增殖、迁移和重塑过程，增加细胞外基质成分沉积，促进血管疾病［5］。而EGFR在AS发病机制中的作用需进一步探讨。本研究采用纯AS敏感C57BL/6J小鼠和腹腔巨噬细胞与50 μg/ml ox-LDL培养48 h，建立典型的巨噬细胞源性泡沫细胞模型，采用EGFR抑制剂AG1478或EGFR-shRNA处理泡沫细胞，探讨EGFR通路在AS机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清、Collagenase Type Ⅰpowder购自Gibco公司；PBS、青-链霉素-两性霉素B溶液（三抗）、油红O、流式专用Buffer、0.25%胰蛋白酶、ROS检测试剂盒、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒、RIPA（强）组织细胞快速裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自Bioswamp；多聚赖氨酸购自Sigma；SYBR Green PCR试剂盒购自KAPA Biosystems；逆转录试剂盒购自TaKaRa；DNaseⅠ购自Fermentas；CO2恒温培养箱购自Thermo公司；荧光倒置显微镜购自Olympus公司；IMS图像分析系统购自武汉华联科生物技术有限公司；荧光定量PCR仪、电泳仪购自Bio-Rad；流式细胞仪购自Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞原代分离 清洁级C57BL/6J小鼠（湖北省疾控中心提供）以颈椎脱臼法处死，全部浸入75%乙醇中5 min，倒立小鼠并向腹腔注射4 ℃预冷DMEM培养液5 ml，仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3 min，静置5～7 min，取出腹腔液（伦理批号：HLK-20210305-001）。进行巨噬细胞纯化，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液继续培养，得到接近纯净的巨噬细胞。

1.2.2 泡沫模型构建 取对数生长期细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为1×106个/ml，接种于12孔培养板，1 ml/孔，培养过夜，细胞贴壁后，模型组加入终浓度为50 mg/L的ox-LDL，共同孵育48 h，油红O染色，显微镜下观察成脂染色效果。

1.2.3 qRT-PCR 取样本于1 ml Trizol匀浆管提取总RNA。将RNA逆转录为cDNA，将制备好的cDNA进行PCR扩增，反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s（40个循环），2-ΔΔCt计算mRNA相对含量。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Western blot 提取蛋白BCA试剂盒测定各组蛋白浓度。在凝胶中（配制12%分离胶和5%浓缩胶）加入20 μg蛋白（浓缩胶80 V 40 min，分离胶120 V 50 min），恒压90 V转膜50 min，5%脱脂奶4 ℃封闭过夜。加入一抗（EGFR 1∶5 000、p-EGFR 1∶2 000、CHOP 1∶250、ATF4 1∶1 000、EIF2α 1∶2 000、p-EIF2α 1∶3 000、Cyt-C 1∶5 000和GAPDH 1∶1 000）室温孵育1 h。洗膜后加入二抗（Goat anti-Rabbit IgG 1∶10 000）室温孵育1 h。加入ECL发光液后置于全自动化学发光分析仪中显色。TANON GIS软件读取相关条带灰度值，每组3次重复。

1.2.5 流式细胞术检测ox-LDL的提取 取生长良好的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，吹打制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清。PBS缓冲液洗涤2次，细胞计数，调整细胞密度为1×106个/ml，加入100 μl单细胞悬液，按抗体名称标记，加入ox-LDL-FITC抗体，4 ℃避光孵育45 min，加入400 μl流式染色缓冲液重悬细胞，4 ℃避光保存。流式细胞仪检测，CYEXPERT软件分析。

1.2.6 ROS检测 按1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA，细胞浓度为1×107个/ml，37 ℃孵育20 min，每隔3～5 min颠倒混匀，使探针和细胞充分接触。无血清细胞培养液洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的DCFH-DA。流式细胞仪检测ROS，CYEXPERT软件分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料采用±s表示。多组间比较使用单因素方差分析，均数间两两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泡沫细胞模型鉴定 ox-LDL处理细胞48 h，油红O染色发现，脂滴在泡沫细胞的细胞质中明显积聚（图1）。说明模型建立成功。

2.2 靶位点筛选 qRT-PCR和Western blot检测各靶点干扰效率。转染细胞后，EGFR表达依次下降（P＜0.01，图2），其中EGFR sh-RNA3干扰效率最好。因此选择质粒3构建EGFR干扰慢病毒进行后续研究。

图2 EGFR相对表达Fig.2 Relative expression of EGFR

2.3 流式细胞术检测泡沫细胞对ox-LDL的摄取与模型组比较，EGFR抑制剂AG1478或EGFR shRNA3均能够显著降低细胞对ox-LDL的提取（P＜0.01，图3）。

图3 流式细胞术检测ox-LDL摄取Fig.3 Uptake of ox-LDL by flow-cytometry

2.4 炎症因子表达 与模型组比较，EGFR抑制剂AG1478组和EGFR shRNA3组IL-6和TNF-α表达均显著降低（P＜0.01，图4）。

图4 IL-6和TNF-α表达Fig.4 Expressions of IL-6 and TNF-α

2.5 细胞内ROS生成 与模型组比较，经AG1478和shRNA3处理后，细胞内ROS水平显著降低（P＜0.01，图5）。

图5 流式细胞术检测ROS生成Fig.5 Flow cytometry detection of ROS production

2.6 Cyt-C释放 与模型组比较，EGFR抑制剂AG1478和shRNA3均能够显著抑制细胞质中Cyt-C表达（P＜0.01，图6）。

图6 Cyt-C释放Fig.6 Release of Cyt-C

2.7 CHOP、ATF4、p-EIL2α和EIF2α相对表达 与泡沫细胞模型相比，抑制EGFR可显著降低p-EIF2α、CHOP和ATF4表达（P＜0.01，图7）。

图7 CHOP、ATF4、p-EIF2α、EIF2α表达Fig.7 CHOP， ATF4， p-EIF2α and EIF2α expressions

3 讨论

AS发展与动脉斑块中慢性炎症和氧化应激密切相关。AS作为心血管疾病之一，一般认为多种炎症细胞和炎症因子在其发病过程中起重要作用。其主要特征在于ox-LDL异常、内皮细胞受损和斑块积聚于血管壁、巨噬细胞泡沫细胞形成和平滑肌细胞增殖［8-13］。ox-LDL是AS发展过程中的主要致病因子，能够诱导ROS产生和AS进展相关炎症因子释放［11，14-15］。

EGFR家族及其配体充当调节多个细胞过程的总机，在正常心脏发育中至关重要，其激活与AS、新生内膜增生和心脏重塑有关［16］。EGFR经常在许多类型人类恶性肿瘤中过表达［17］。本实验通过成功建立泡沫细胞模型，研究EGFR与AS的关系，EGFR抑制剂AG1478或EGFR shRNA均能抑制EGFR表达，且抑制EGFR表达能够显著降低泡沫细胞对ox-LDL的提取。ox-LDL在AS过程中具有重要功能，诱导ROS过量产生、黏附分子释放和内皮细胞损伤途径，并与炎症密切相关［15，18］。内皮细胞损伤和内皮功能障碍被认为是AS过程的第一步［19］。氧化应激在心血管疾病进展中起关键作用，尤其是ROS非常普遍地伴随AS典型症状发展［20］。过量ROS产生会直接破坏细胞膜、蛋白质和DNA［21］。研究证明，氧化应激通过增强炎症促进动脉壁结构重塑［22］。证明ROS参与AS发展，并表明EGFR参与ROS产生。已有报道证明ROS生成与EGFR-PI3K-AKT/ERK信号通路相关［23-24］。本实验通过EGFR抑制剂AG1478或EGFR shRNA降低了ROS产生。

炎症已被证明在AS斑块发生和发展中起重要作用。早期AS的原因为内皮损伤、脂质代谢异常和血流动力学损伤。IL-6是一种多效细胞因子，涉及固有和适应性免疫系统，用于调节急性期反应和慢性炎症［25］。冠心病患者血液中发现IL-6水平显著高于健康者，且病情越严重，体内炎症指数越高［26］。斑块破裂情况下，IL-6显著增加，IL-6可能是预测AS斑块易损性的潜在标志物［27］。TNF-α作为一种促炎细胞因子，在AS相关炎症中起重要作用，抑制TNF-α产生可能对AS抗炎治疗具有重要意义。本实验中，抑制EGFR能够显著降低泡沫细胞中ROS生成以及炎症因子IL-6、TNF-α表达。

研究表明，ROS诱导线粒体膜渗透变化，促进Cyt-C释放［28］。本研究中，抑制EGFR表达能够显著降低泡沫细胞细胞质中Cyt-C表达。病理条件（如内质网功能受损）导致内质网应激，促进巨噬细胞源性泡沫细胞形成，并在AS发展和进展中发挥重要作用［29］。本实验中抑制EGFR可显著降低内质网应激途径相关p-EIF2α、CHOP和ATF4蛋白表达。

综上，本实验采用泡沫细胞模型，通过加入EGFR抑制剂，发现能够降低炎症因子、氧化应激和内质网应激，从而减轻AS，为AS临床治疗提供了新思路。