五味子乙素通过TLR4/NF-κB信号通路对急性胰腺炎大鼠肺部损伤的影响

黄夏冰 王馨苑 李娟 陈一萍 农焦 黄德庆 （.广西中医药大学第一附属医院急诊科，南宁 500；.广西中医药大学发展规划处，南宁 500；.广西中医药大学第一附属医院儿科，南宁 500；.广西中医药大学第一附属医院教学部，南宁 500）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种急性腹部急危重症，病情进展迅速且凶险，可诱发胰腺及全身炎症，其中肺脏是最常被累及的器官，导致的急性严重肺损伤是造成AP患者死亡的主要原因，尽早防治可有效提升患者生存率［1-2］。炎症细胞因子过量分泌引发并放大的全身炎症级联反应是导致AP患者急性肺损伤的主要因素，减少血清淀粉酶及炎症因子水平，进行抗炎治疗能够显著减轻AP引发的肺损伤［3-4］。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是脂多糖激活炎症级联反应必需的一种信号受体，可促进核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）蛋白核转移，进而引发机体组织炎症，在AP发生发展过程中发挥关键作用［5］。抑制TLR4/NF-κB通路激活可显著减弱脂多糖诱导的肺组织炎症，改善急性肺损伤，提示TLR4/NF-κB信号是治疗AP后肺损伤的重要靶点［6-7］。五味子乙素是提取自中药北五味子中的一种联苯环辛烯类木脂素，具有明显的抗感染、抗炎与抗氧化活性，可通过抑制氧化应激和炎症反应减轻2型糖尿病大鼠肾损伤，并可抑制NF-κB信号激活，缓解脓毒症诱发的急性肺损伤［8-9］。但五味子乙素能否通过TLR4/NF-κB信号改善AP相关肺部损伤，目前还不清楚。本文通过构建AP肺损伤大鼠模型，对此问题进行探究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠购于广州启特生物科技有限公司，许可证号：SYXK（粤）2021-0245。在屏障环境下分笼饲养，每笼5～6只，大鼠自由饮水、进食，饲养室温度为23～25 ℃，相对湿度为55%～60%，照明以12 h/12 h明暗交替进行。本研究获得武汉华联科生物技术有限公司伦理委员会审批通过，批件号：HLK-2022107496。

1.1.2 主要试剂与仪器 五味子乙素（规格：HPLC≥98%，20 mg，货号：S19861-20 mg）购于上海吉至生化科技有限公司；牛磺胆酸钠（纯度：HPLC≥98%，货号：ST8040）、兔SP检测试剂盒（货号：SP0021）购于北京索莱宝科技有限公司；兔源MYD88一抗、大鼠IL-6 ELASA试剂盒、大鼠IL-18 ELASA试剂盒、兔源GAPDH一抗、兔源NF-κB p65一抗、兔源PCNA一抗、羊抗兔二抗（货号：ab219413、ab234570、ab213909、ab9485、ab16502、ab92552、ab150077）购于美国Abcam公司；HE染色试剂盒、兔源TLR4一抗、RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、兔源p-NFκB p65一抗（货号：C0105、AF8187、P0013K、P0011、AF5875）购于上海碧云天公司。

小动物无创肺功能仪购于上海玉研科学仪器有限公司；全自动生化分析仪（型号：AU 2700）购于日本Olympus公司；血气分析仪（型号：RAPIDPoint 500）购于德国Siemens公司；全波长酶标仪（型号：SLFAD）购于美国Bio Tek公司；生物组织包埋机（型号：YD-6D）购于浙江省金华市益迪医药设备厂；组织石蜡切片机（型号：1015）购于德国LEICA公司；正置显微镜（型号：ECLIPSE 80i）购于日本Nikon公司；组织匀浆机（型号：Precellys 24）购于法国Bertin公司；电子天平（型号：ML204）购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；稳压稳流电泳仪（型号：DYY-6B）购于北京六一仪器厂；蛋白转印系统、凝胶成像仪（型号：Trans-Blot Turbo、170-8200）购于美国Bio-Rad公司等。

1.2 方法

1.2.1 建立AP大鼠模型及分组给药 制备AP模型的方法参照文献［10］：将牛磺胆酸钠加入生理盐水中溶解混匀，制备为质量浓度为5%的溶液备用，SD大鼠禁食12 h后，通过腹腔注射剂量为40 mg/kg的3%戊巴比妥钠溶液麻醉，仰卧固定后，腹部备皮、消毒、于正中切开（切口约2 cm），暴露十二指肠后夹闭近肠端和近肝门端胰胆管，向胆胰管内逆行注射1.5 ml/kg的5%牛磺胆酸钠溶液，然后去除动脉夹，按压并封闭穿刺孔，复位肠管后缝合切口，若观察到大鼠胰腺出现水肿、出血症状，且呼吸困难急促，肺部听诊有杂音，表明模型制备成功。经随机数表法分为模型组、五味子乙素组、TLR4过表达载体组、TLR4空载组、五味子乙素+TLR4过表达载体组，每组12只大鼠，再取12只SD大鼠仅翻动肠管不注射5%牛磺胆酸钠，作为假手术组。

将五味子乙素加入生理盐水中溶解混匀，制备为8 mg/ml的药液［9］，五味子乙素+TLR4过表达载体组大鼠腹腔注射10 ml/kg五味子乙素药液（1次/d），同时静脉注射0.5 ml腺病毒包装的TLR4过表达载体（1×1011PFU，1次/周）［11］；五味子乙素组大鼠腹腔注射10 ml/kg五味子乙素药液（1次/d），同时静脉注射0.5 ml生理盐水（1次/周）；TLR4过表达载体组大鼠腹腔注射10 ml/kg生理盐水（1次/d），同时静脉注射0.5 ml腺病毒包装的TLR4过表达载体（1×1011PFU，1次/周）；TLR4空载组大鼠腹腔注射10 ml/kg生理盐水（1次/d），同时静脉注射0.5 ml腺病毒包装的TLR4空载体（1×1011PFU，1次/周）；模型组和假手术组大鼠腹腔注射10 ml/kg生理盐水（1次/d），同时静脉注射0.5 ml生理盐水（1次/周），共用药2周。

1.2.2 肺功能检测 最后1次药物干预结束后24 h，采用无创肺功能仪测定肺功能指标：吸气阻力（resistance inspiratory，Ri）、每分通气量（minute ventilation，MV）、呼气峰流值（peak expiratory flow，PEF），全身体积描记系统参数：气泵流量2 L/min，传感器放大500倍，采样频率200 Hz，输入校准-50。

1.2.3 标本采集及大鼠动脉血气、腹水量与肺组织W/D检测 肺功能检测结束后，吸入乙醚麻醉大鼠，采集颈动脉血，以血气分析仪测定其中二氧化碳分压（arterialpartial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）与氧合指数（oxygenation index，OI），OI计算公式为：OI=PaO2/FiO2（吸氧浓度），因大鼠在本实验中均自由呼吸，FiO2为空气中氧浓度0.21。再次采集颈动脉血1.1 ml，离心收集上清，将其分组标记后保存在-80 ℃条件下；抽取大鼠腹水并测量其体积，然后开胸取出肺脏，左右肺对半剪开，称量右肺湿重，以烤箱烤干后称量其干重，计算湿重/干重（W/D）；左肺组织剪下约0.6 g，剪成小碎块，加入RIPA裂解液匀浆、离心、收集上清，BCA试剂盒测定其中蛋白总浓度后，将其分组标记并保存在-80 ℃条件下；其余左肺组织经漂洗、固定、脱水、透明、包埋后切片备用。

1.2.4 肺组织病理形态检测 1.2.3中的肺组织切片取出后，每只大鼠选3张切片，经脱蜡、水化后进行HE染色，脱水、透明、封片、镜下观察，拍照后以显微镜自带的系统分析肺组织的病理改变情况，以如下标准进行Holfbauer评分［12］：肺组织完好，无病理损伤，计0分；25%视野出现水肿、出血、炎症浸润等病理改变，计1分；50%视野出现水肿、出血、炎症浸润等病理改变，计2分；75%视野出现水肿、出血、炎症浸润等病理改变，计3分；全部视野出现水肿、出血、炎症浸润等病理改变，计4分。

1.2.5 血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平测定 取1.2.3中的血清，冻融后采用ELISA试剂盒测定炎症细胞因子IL-6、IL-18水平，以全自动生化分析仪测定血清淀粉酶水平。

1.2.6 肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白水平检测 取1.2.3中的肺组织蛋白样品液，冻融后每组取20 μg总蛋白变性后以电泳分离，湿转后以5%脱脂奶粉封闭其非特异位点，将目的蛋白TLR4、PCNA、核内NF-κB p65、GAPDH自膜上剪下后，分别以相应一抗孵育，洗膜后孵育二抗，显影后拍照，以Quantity One软件定量各蛋白灰度值后进行统计分析，最后得到其相对表达量。

1.2.7 肺组织病理形态检测 1.2.3中的肺组织切片取出后，每只大鼠再次选3张切片，同样脱蜡、水化后孵育稀释100倍的兔源TLR4一抗溶液，使用兔SP检测试剂盒孵育二抗后，进行DAB显色、苏木素复染处理，最后封片观察TLR4蛋白着色情况，每张切片随机选6个视野拍照，通过Image J软件分析图片，定量细胞数后计算TLR4阳性细胞比例（%）=TLR4阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS24.0软件对实验数据进行统计分析，以±s表示，两组间的差异比较采用t检验；多组间差异比较行单因素方差分析，两两进一步比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能检测结果 与假手术组相比，模型组大鼠MV、PEF显著降低（P＜0.05），Ri显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠MV、PEF均升高（P＜0.05），Ri均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠MV、PEF均降低（P＜0.05），Ri均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠MV、PEF与Ri差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺功能指标MV、PEF与Ri水平（±s，n=12）Tab.1 Levels of pulmonary function indexes MV， PEF and Ri of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector MV/ml 7.39±0.45 3.28±0.221）6.70±0.712）3）PEF/（ml·s-1）61.47±8.29 34.66±3.951）57.58±8.122）3）Ri/（kPa·s·L-1）26.87±4.43 67.31±8.761）28.72±4.682）3）1.56±0.182）3）9.84±2.432）3）93.16±10.752）3）3.34±0.33 34.95±4.13 67.02±10.81 2.89±0.31 32.52±3.94 65.34±11.06

2.2 各组大鼠动脉血气检测结果 与假手术组相比，模型组大鼠PaO2、OI显著降低（P＜0.05），PaCO2显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠PaO2、OI均升高（P＜0.05），PaCO2均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠PaO2、OI均降低（P＜0.05），PaCO2均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠PaCO2、PaO2与OI差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠动脉血气相关指标PaCO2、PaO2与OI水平（±s，n=12）Tab.2 Levels of PaCO2， PaO2 and OI in arterial blood gas of rats in each group （±s，n=12）

表2 各组大鼠动脉血气相关指标PaCO2、PaO2与OI水平（±s，n=12）Tab.2 Levels of PaCO2， PaO2 and OI in arterial blood gas of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector PaCO2/mmHg 38.92±1.53 52.83±2.041）40.17±2.122）3）PaO2/mmHg 98.76±1.12 63.54±1.911）94.35±5.032）3）OI 470.29±8.13 302.57±5.791）449.28±7.962）3）61.95±2.782）3）47.82±3.282）3）227.71±9.522）3）53.04±2.35 64.03±2.25 304.90±5.81 50.29±3.16 60.37±3.14 287.48±6.08

2.3 各组大鼠腹水量与W/D检测结果 与假手术组相比，模型组大鼠腹水量与W/D显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠腹水量与W/D均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠腹水量与W/D均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠腹水量与W/D差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠腹水量与W/D（±s，n=12）Tab.3 Ascites volume and W/D of rats in each group（±s， n=12）

表3 各组大鼠腹水量与W/D（±s，n=12）Tab.3 Ascites volume and W/D of rats in each group（±s， n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector Ascites volume/ml 0.35±0.11 10.81±1.341）1.74±0.572）3）14.96±1.862）3）10.32±1.53 W/D 4.26±0.41 6.47±0.731）4.53±0.502）3）8.24±0.642）3）6.59±0.61 9.48±0.95 6.12±0.52

2.4 各组大鼠肺组织病理形态检测结果 假手术组肺组织形态正常完好，无病理损伤，Holfbauer评分为0。模型组大鼠肺泡缩小塌陷，间隔变宽，肺组织出现水肿、出血及炎症细胞大量浸润等病理损伤，Holfbauer评分相较于假手术组显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠肺组织上述病理损伤改变程度均减轻，Holfbauer评分均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠肺组织上述病理损伤改变程度均加重，Holfbauer评分均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠肺组织上述病理损伤程度无明显改变，Holfbauer评分差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图1。

图1 HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态（×200）Fig.1 Pathological morphology in lung tissue of rats in each group was observed by HE staining （×200）

表4 各组大鼠肺组织Holfbauer评分（±s，n=12）Tab.4 Holfbauer score of rats lung tissue in each group（±s，n=12）

表4 各组大鼠肺组织Holfbauer评分（±s，n=12）Tab.4 Holfbauer score of rats lung tissue in each group（±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector Holfbauer/point 0 2.67±0.371）0.75±0.242）3）3.67±0.282）3）2.58±0.42 2.25±0.50

2.5 各组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平检测结果 与假手术组相比，模型组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平（±s，n=12）Tab.5 Levels of serum amylase and inflammatory cytokines IL-6 and IL-18 in each group （±s，n=12）

表5 各组大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平（±s，n=12）Tab.5 Levels of serum amylase and inflammatory cytokines IL-6 and IL-18 in each group （±s，n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector Amylase/（U·L-1）1 026.53±50.195 2 934.16±72.841）11 1 057.72±58.732）3）5 3 894.64±91.652）3）16 2 921.92±74.3211 2 901.23±70.5710 IL-6/（ng·L-1）3.24±6.36 4.83±15.621）8.95±5.682）3）IL-18/（μg·L-1）0.39±0.08 1.17±0.131）0.43±0.072）3）8.47±20.142）3）1.85±0.162）3）6.52±16.17 1.19±0.12 9.21±20.13 1.12±0.20

2.6 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达检测结果 与假手术组相比，模型组大鼠肺组织TLR4阳性细胞比例、TLR4与MYD88蛋白表达、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著升高（P＜0.05）。与模型组、五味子乙素+TLR4过表达载体组分别相比，五味子乙素组大鼠肺组织TLR4阳性细胞比例、TLR4与MYD88蛋白表达、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均降低（P＜0.05）；TLR4过表达载体组大鼠肺组织TLR4阳性细胞比例、TLR4与MYD88蛋白表达、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平均升高（P＜0.05）。与模型组相比，TLR4空载组大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、图3、表6。

图2 免疫组化染色检测各组大鼠肺组织TLR4蛋白表达（×200）Fig.2 Expression of TLR4 protein in lung tissue of rats in each group was detected by immunohistochemical staining （×200）

图3 免疫印迹检测各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达Fig.3 TLR4/NF-κB signaling pathway proteins expressions in lung tissue of rats in each group were detected by Western blot

表6 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白相对表达（±s，n=12）Tab.6 Relative expressions of TLR4/NF-κB signaling pathway proteins in lung tissue of rats in each group （±s， n=12）

表6 各组大鼠肺组织TLR4/NF-κB信号通路蛋白相对表达（±s，n=12）Tab.6 Relative expressions of TLR4/NF-κB signaling pathway proteins in lung tissue of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with sham operation group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with schisandrin B+TLR4 overexpression vector group， 3）P＜0.05.

Groups TLR4/GAPDH Sham operation Model Schisandrin B TLR4 overexpression vector TLR4 empty Schisandrin B+TLR4 overexpression vector 0.54±0.12 1.21±0.181）0.59±0.072）3）1.96±0.252）3）1.19±0.20 MYD88/GAPDH 0.45±0.10 1.18±0.121）0.51±0.082）3）1.83±0.242）3）1.17±0.23 p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.48±0.09 1.30±0.231）0.53±0.082）3）2.04±0.172）3）1.32±0.26 1.16±0.19 1.11±0.22 1.25±0.20

3 讨论

AP作为一种常见的急诊科重症疾病，近年来患病人数处于上升趋势，大多数患者会因全身炎症出现急性肺损伤，造成肺功能衰竭，是导致患者住院时间延长甚至死亡的重要因素［12-14］。本研究以胆胰管内逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法诱导建立AP模型，结果显示，造模大鼠血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平明显升高，诱发了全身炎症，造成腹水及肺部水肿，导致肺泡缩小塌陷，间隔变宽，肺组织出现水肿、出血及炎症细胞大量浸润等病理损伤，损害了肺功能，使MV、PEF、PaO2、OI显著降低，Ri、PaCO2显著升高，揭示AP肺损伤模型构建成功。

AP不仅可损害胰腺组织，还可诱发全身炎症，进而造成肺组织损伤，抑制机体炎症是防治AP所致肺损伤的有效方法［15-16］。五味子乙素是一种天然抗炎化合物，可抑制炎症因子表达，减轻脂多糖引起的肺上皮细胞炎症，并可通过提高组织抗氧化活性减轻肺组织氧化应激损伤，延缓肺纤维化［17-18］。本研究以五味子乙素处理AP肺损伤大鼠，可明显降低其血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平，抑制炎症，减轻肺组织病理损伤改变，缓解腹水与肺组织水肿，提高MV、PEF、PaO2、OI，降低Ri、PaCO2，修复肺功能，表明五味子乙素可显著改善AP引发的肺组织损伤，具有明显的肺保护作用。

TLR4/NF-κB是启动炎症级联反应的重要信号通路，参与介导AP的发病与病情进展过程，下调TLR4蛋白表达可抑制NF-κB蛋白的核转移，减弱氧化应激和炎症，并可抵抗胰腺巨噬细胞炎性激活，缓解AP病理症状，并减轻脂多糖引发的急性肺损伤［7，19-20］。本研究以TLR4过表达载体处理AP大鼠，可提升血清淀粉酶与炎症细胞因子IL-6、IL-18水平，加重肺组织水肿及腹水症状，并促使肺部炎症进展，进一步损害肺功能，表明TLR4/NF-κB通路参与介导AP引发的肺损伤过程，与上述提及的既往研究结果相似，而本研究结果显示五味子乙素可降低AP大鼠肺组织中TLR4阳性细胞比例，下调其TLR4/NF-κB通路蛋白表达，减轻大鼠肺部炎症损伤，表明TLR4/NF-κB通路在五味子乙素对AP引发肺损伤的治疗过程中发挥重要调控作用；另外，当五味子乙素与TLR4过表达载体合用时，TLR4过表达载体可减弱五味子乙素的抗炎作用，并拮抗其对肺部炎症损伤的改善作用，最终逆转五味子乙素的肺功能修复功效，表明五味子乙素改善AP大鼠肺部损伤并修复肺功能是通过下调TLR4/NF-κB信号通路实现的。

综上所述，本研究证实五味子乙素可以下调TLR4蛋白表达，抑制NF-κB磷酸化，抵抗AP引起的肺部炎症，缓解肺损伤，减轻腹水与肺部水肿症状，促使肺功能恢复，下调TLR4/NF-κB信号通路是其起到上述药理功效的作用机制之一，为AP提供了新的治疗思路，并对五味子乙素的临床推广应用做出了一定贡献。