连续式微滤膜分离乳清蛋白的研究

于声波，刘宇，白茹，高增丽，乌云，曹文慧，母智深*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司全球研发创新中心，呼和浩特 011517；2.内蒙古自治区乳品营养健康与安全企业重点实验室，呼和浩特 011517）

0 引 言

乳清蛋白和酪蛋白是牛乳蛋白的主要组成成分，在拥有不同的功能特性和营养价值的同时又都是食品工业中重要的基础原料。乳清蛋白最早来源于干酪生产的副产品，根据干酪生产工艺的不同又分为酸乳清和甜乳清，通过不断研究和应用发现乳清蛋白拥有良好的乳化性和起泡性[1]，因此对乳清蛋白的研究逐渐成为食品科学领域的热点。使用膜分离工艺生产的乳清蛋白被称为天然乳清蛋白，由于生产过程始终处于温度较低的中性环境，所以能够很好的保护乳清蛋白的活性不变，因此膜法制备的天然乳清蛋白相比酸乳清和甜乳清拥有更好的营养价值，是一种更优良的食品原料和添加剂[2-4]，同时还有良好的生物相容性和生物降解性[5]。

微滤膜分离技术是一种高效、节能环保的非热物理分离技术，适合分离温度敏感的热敏性营养物质。牛乳中酪蛋白和乳清蛋白的质量比约为80∶20，其中95%的酪蛋白以胶束的形式存在，粒径分布在40~300 nm之间且主要集中在200 nm 左右。微滤膜过滤技术常被用来分离乳中的乳清蛋白和酪蛋白胶束，通常选择膜孔径在0.1~0.2 μm 的陶瓷或高分子微滤膜，JRGENSEN 等[6]研究了微滤膜孔径和跨膜压力对分离效果的影响，最终确定0.1 μm 适合作为分离乳清蛋白的膜孔径，分离温度为50~55 ℃，在保证热敏性物质稳定的情况下提高分离温度有助于获得更高的膜通量[6]。由于更低的分离温度不但可以在分离过程中控制微生物生长，还能最大程度的保持热敏营养物质的活性[7]，低温微滤也逐渐成为研究的热点[8-11]。当温度低于4 ℃时，酪蛋白胶束中的β-酪蛋白能够从酪蛋白胶束中解离并处于游离状并通过微滤膜进入透过液中，实现β-酪蛋白的分离[12]。羊乳在组成成分上与牛乳不同，但同样可以使用微滤膜分离技术分离羊乳酪蛋白和乳清蛋白，姜竹茂等[13]研究了利用多级微滤膜分离羊乳酪蛋白。张雨萌等[14]研究了不同孔径国产陶瓷膜对脱脂牛、羊乳中酪蛋白和乳清蛋白过程和膜性能参数的影响。

目前由于大规模应用微滤膜分离技术的场景有限，研究主要集中在批次式的分离方式，这种分离方式与工业化连续式的生产需求存在一定的不同。批次式生产产能小，不可连续，更多的生产间隔易产生安全风险。因此本研究聚焦于中试规模的连续化分离方式，其优点在于生产连续，产能稳定。同时在洗滤方面，本研究使用了和批次式生产不同的连续在线加水洗滤方式，能够达到在相同的洗滤效果下节约用水。但连续式分离也存在实验时间较长，膜表面污堵逐渐沉积导致的膜通量下降等需要研究改进的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生牛乳（总固形物13±1%），内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司牧场；盐酸、硫酸、乙醚、硼酸、氢氧化钠、甲基红指示剂、溴甲基绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、硝酸、高氯酸，中国国药集团有限公司；淀粉酶、α-乳白蛋白对照品、β-乳球蛋白对照品、乙醇、乙酸，Sigm a公司；三氟乙酸、三氟乙酸乙腈，百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

微滤膜系统（定制），洁翼流体公司；ISO FLUX 陶瓷微滤膜，法国TAMI 公司；Agilent 1200 高效液相色谱仪、poroshell 120 色谱柱，美国安捷伦公司；XPR 226CDR/AC 天平，梅特勒-托利比多仪器(上海)有限公司；CR 21GII 离心机，日本日立公司；PHS-25 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；K jeltec8200 自动凯氏定氮仪，丹麦FOSS 公司；AA 6880 PLUS 原子吸收光谱仪，日本岛津公司；TANK 40 微波消解仪，上海新仪微波化学科技有限公司；科恒101 恒温鼓风干燥箱，青岛科隆达仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微滤膜分离实验

实验使用陶瓷微滤膜，三级膜共使用21 支单体膜，每支膜面积为0.2 m2，总面积共计4.2 m2。采用连续式在线加水洗滤分离方式。

设备流程如图1 所示，生乳经过巴氏杀菌（75 ℃，15 s）离心脱脂后进入Tank1 脱脂奶进料罐，在进料泵B1 驱动下依次经过串联的M F1，M F2，M F3 三级微滤膜进行分离，三级膜所有的截留液收集至截留液储存罐Tank2，纯净水经洗滤水泵B4 进入二三级微滤膜进行洗滤分离，三级所有透过液收集至透过液储存罐Tank3 中，为方便计算，各个平衡罐均为带有液位检测功能的食品级不锈钢储罐。生牛乳部分理化指标为蛋白质3.21 g/100 g、脂肪4.0 g/100 g、乳糖4.86 g/100 g、总固形物含量为12.44 g/100 g，部分脱脂乳理化指标为蛋白质3.4 g/100 g、脂肪0.17 g/100 g、乳糖5.27 g/100 g、总固形物含量9.55 g/100 g。单次实验使用脱脂乳约1 200 L。

图1 设备流程

1.3.2 膜通量测定

膜通量是指在单位时间内通过单位膜面积的物质的量，通常作为衡量膜分离效率的依据，膜通量越大表示单位时间内膜两侧的物质交换越多，膜的处理量越大。

式中：JF为膜通量；V为T时间内从原料液中穿过M F 膜进入滤过（渗透）液中的水的体积；A为M F膜的膜面积。

1.3.3 清洗恢复率（RC）

式中：Rc表示清洗恢复率；fw为标准水通量（水通量通常被用来评价C IP 后M F 膜的清洗效果，M F 膜第一次使用之前或完全清洗干净后的膜通量为标准水通量）；fc为C IP 后的膜通量。

1.3.4 分离率

本文中分离率的计算参考YANG B Y 等[15]的方法。

式中：rem oval 为各物质的分离率（%）；[SP]retentate为截留液中某物质的质量；[SP]SGM为脱脂奶原料中某物质的质量；CF为浓缩倍数。

1.3.5 跨膜压力

式中：TM P 为跨膜压力；Pin为截留液进口压力；Pout为截留液出口压力；Pp为透过液侧压力。

1.3.6 蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[16]进行检测。

1.3.7 脂肪含量测定参照GB 5009.6—2016—3《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[17]进行检测。

1.3.8 总固形物含量测定参照GB 5413.39—2010《食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定》[18]进行检测。

1.3.9 α-乳白蛋白测定参照T/TDSTIA 002—2021《奶及奶制品中α-乳白蛋白的测定高效液相色谱法》方法进行检测。

1.3.10 β-乳球蛋白测定参照T/TDST IA 007—2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的测定液相色谱法》方法进行检测。

1.3.11 钙、镁、钠、钾测定

参照GB/T 5009.92—2016《食品中钙的测定》[19]、GB/T 5009.241—2017 《食品中镁的测定》[20]、GB/T 5009.91—2017《食品中钾、钠的测定》[21]。

2 结果与讨论

2.1 连续式微滤膜分离通量随时间变化情况

实验使用脱脂奶为原料，实验温度为50 ℃，跨膜压力为0.08 M Pa，浓缩倍数为3.5 倍。本文中使用L/(m2·h)作为膜通量的单位，记为LPH。

批次式微滤膜分离制备过程中，膜通量随着时间增加而显著降低且过程不可逆，清洗后才能恢复正常通量，从而导致相比于连续式生产，其生产时间长，生产效率低且批次之间的时间间隔会增加产品污染的风险[22]。本实验所用连续式微滤膜分离设备设计为三级M F 膜以串联方式连接，通过一级M F 膜分离浓缩，二、三级M F 膜在线加水洗滤的方式实现连续分离乳清蛋白和酪蛋白。分离、洗滤同时进行的方式避免了批次式生产每次洗滤后加水导致的停机，节约洗滤水用量，提高了生产效率；一级分离，二级洗滤的方式可以尽可能地减缓膜堵塞的时间，从而延长总体的生产时间。连续式膜分离通量随时间的变化趋势如图2 所示。

图2 膜通量随时间变化曲线

一级膜在分离阶段起到的作用最大同时由于一级膜在分离过程中没有加水洗滤所接触的物料浓度最大，污堵情况最严重，所以总体上一级膜初始通量最小，通量降低的速度也最快。随着实验时间增加，部分与膜孔径相似的酪蛋白胶束堵塞部分膜孔，膜表面开始形成一层沉淀污堵，三级膜组都出现通量下降的情况，各级膜通量下降的程度有明显区别。二、三级膜在分离过程中以洗滤为主，所以二，三级中循环的料液浓度较低，且可能导致污堵的100~200 nm 左右的酪蛋白胶束已部分在一级膜表面沉淀，所以二，三级膜通量下降情况优于一级膜。经过240 min 实验之后，二级通量下降约8 %，3 级通量下降9.9 %，而一级膜通量从开始的44.6 LPH 经过240 min 后降到36.9 LPH，通量下降约17.2 %。同时通过图中曲线趋势可以看出一级膜通量下降趋势明显快于其他两级，随着实验时间的进一步增加一级膜的通量将继续下降，导致分离效率降低，因而将成为影响整体膜通量的主要因素。后续研究中可以通过单独冲洗一级膜、增加一级循环流量及设置反冲洗装置等方法减缓或恢复一级膜通量，从而延长整体生产时间。

2.2 跨膜压力对膜通量的影响

跨膜压力是影响微滤膜分离膜通量变化、分离效果和清洗效率等最主要的因素之一。理论上跨膜压力越大，单位时间截留液和渗透液之间的跨膜物质交换越多，分离或浓缩效率越高。但同时带来的负面效果是膜表面的污堵现象越严重，污垢积累的速度越快，膜通量下降的速度越快。膜表面形成的不可逆沉淀量与跨膜压力成正相关关系，不可逆沉淀越多，终产率越低，清洗难度越大。实验通过固定截留液侧压力，调节透过液出口压力的方式实现跨膜压力的变化，设置0.08、0.11、0.14 M Pa 3 个压力梯度，实验温度为50 ℃，浓缩倍数为3.5。

由图3 曲线可知，跨膜压力与总通量为正相关关系。TM P 升高0.06 M Pa 总通量升高约24%，意味着相同的实验时间更多的乳清蛋白跨过微滤膜进入透过液中。随着实验时间的增加，膜通量开始下降，生成一部分不可逆的沉淀堵塞膜孔道或在膜表面形成空间位阻影响物质的通过。本次实验使用的微滤膜孔径为0.1 μm，污堵的主要成分酪蛋白胶束粒径大小实际分布在0.04~0.3 μm 之间，小部分粒径和膜孔经相似的酪蛋白附着在膜表面或膜孔内，之后蛋白质之间通过相互作用形成沉淀污阻层。跨膜压力越大则形成的膜堵越快，不可逆沉淀越牢固。膜表面的污堵沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀2 种，可逆沉淀对于膜堵问题影响小，可以通过增大循环流量，改变膜面流速等方式减轻或规避。而不可逆沉淀的形成后只能通过有效的原位清洗(CIP)解决。通常情况下通过测量水冲恢复率来评价不可逆沉淀的产生情况，具体操作为实验结束后水冲30 min 直至系统内水透明时记录水冲恢复率f1。C IP 过程依次为水冲洗30 min，2.5%浓度氢氧化钠溶液80 ℃循环30 min，0.75 %硝酸溶液60 ℃循环30 min，清洗结束之后记录最终的恢复率。

图3 不同跨膜压力条件下膜通量与时间变化关系

如图4 所示，跨膜压力升高导致的不可逆沉淀显著性增加，水洗恢复率f1逐渐降低，TM P 从0.08 M Pa 升高到0.14 M Pa 而f1从85.4%降低至60.6%。跨膜压力虽然能够带来高通量，但是更严重、更快速的污堵则可能导致保证生产效率的生产时间简短，如何平衡跨膜压力与生产效率的关系仍待后续研究。经过完整CIP清洗之后各跨膜压力实验后清洗恢复率fc同初始水通量fw相比均恢复至实验开始时的水平，证明清洗方案合适且仍有部分剩余清洗能力，所以在条件允许的情况下仍可以提高跨膜压力或延长实验时间从而进一步提升分离能力。

图4 不同跨膜压力实验后的清洗结果

2.3 连续式膜分离过程分离效果随时间的变化

受实验设备所限目前关于微滤膜分离的研究大都集中在批次式实验方式，中试级别的连续式技术可以参考的研究较少。本文研究了长时间连续式微滤膜分离过程中分离组分随实验时间变化的情况，设定的实验温度为50 ℃，跨膜压力为0.14 M Pa 时，浓缩倍数为3.5 倍，连续实验150 min，间隔相同时间检测截留液中指标数据，实验结果如表1 所示。

表1 截留液及透过液中蛋白质组成随时间变化

在跨膜压力、温度及浓缩倍数均不变的情况下，截留液及透过液中各蛋白质组分随时间变化情况如表1 所示。从表中数据可以看出，使用0.1 μm 孔径微滤膜分离酪蛋白效果优异。其中透过液中几乎不含酪蛋白。如图5 所示，随着实验时间的增加，截留液中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白2 种乳清蛋白主要组成物质浓度随着时间的增加逐渐变高，透过液中的乳清蛋白含量逐渐减少，分离效率逐渐降低。其原因主要是随着实验时间的增加，膜表面的污堵逐渐增加，部分蛋白质在膜表面沉积形成污堵层，使得微滤膜有效的过滤孔径逐渐小于0.1 μm，膜通量降低导致相同时间内通过膜的目标分子数量减少。实验进行150 min 之后，透过液中的α-La 浓度从开始时的823.9 m g/L 下降至517.1 m g/L(下降约37%)，β-LG 浓度从开始时的3 027.7 m g/L 下降至1 923.6 m g/L（下降约36.5%）。因此乳清蛋白和酪蛋白的分离效率受生产时间的影响，后续工业化应用时需考虑分离效率与成本之间的关系。与批次式实验方式不同，连续式实验使用在线加水洗滤的方式，实验中不会停止，无法采用破坏体系稳定性的方法恢复部分通量，污垢会不断在膜表面沉积，若想获得更好的分离效果，需要使用其他的控制工艺，如实验开始时使用较小跨膜压力逐渐升高至目标压力或增加膜内循环流量，提高膜表面流速等。

图5 截留液中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白组成比例随时间变化

2.4 跨膜压力（TMP）对乳清蛋白组成比例的影响

乳清蛋白是牛奶中蛋白质的重要组成成分，约占牛奶总蛋白质的20%，其中绝大部分由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白组成，α-La 是基本氨基酸和支链氨基酸的极好来源，有助于调节睡眠、情绪和压力。β-LG是乳清蛋白的主要组成成分，同时也是婴儿致敏性蛋白质的一种，但是添加适度水解β-LG 有益于调节婴儿肠道健康[23-25]。组分单一的高纯度蛋白质无论是试剂还是原料在未来的应用都将变得越来越重要。初步将乳清蛋白和酪蛋白分离后，进一步研究了分离的乳清蛋白中α-La 和β-LG 的分布情况，发现2 种蛋白质的比例会受到跨膜压力的影响，实验使用50 ℃温度作为生产温度，分别设定跨膜压力为0.08、0.11、0.14 M Pa，实验进行240 min 每隔相同的时间取样检测透过液中α-La 和β-LG 的含量并计算平均2 种蛋白质的分离率。2 种蛋白质分离率随跨膜压力变化情况如图6 所示。

图6 不同跨膜压力下α-La 和β-LG 的含量变化

随着跨膜压力的升高，更多的乳清蛋白从截流液中穿过膜进入透过液中，其中α-La 随跨膜压力变化不明显。β-LG 的跨膜运动情况有明显的变化，跨膜压力从0.08 M Pa 升至0.14 M Pa 时，β-LG 的分离率从79.3 %升高到92.7 %，升高的幅度较为明显。而2 种蛋白比例变化的原因为α-La 和β-LG 分子量大小不同(α-La 分子量约为14 ku 左右，β-LG 分子量约为18 ku左右，以二聚体形式存在)，在正常膜表面没有沉积的情况下2 种蛋白可以正常的通过膜孔，随着膜表面的沉积，部分膜孔被与膜孔径相似的蛋白质堵塞且沉积在膜表面的蛋白质交联导致实际微滤膜选择通过分子量变小，对于分子量较大的β-LG 更难通过膜孔。调整乳清蛋白中2 种主要蛋白质的比例对于后续进一步分离纯化α-La 和β-LG 或相应的应用有重要意义，如根据不同应用场景对于乳清蛋白比例的要求，使用跨膜压力进行调整。

2.5 金属离子在截留液及透过液中的分布情况

牛奶中的金属离子除了是重要的营养元素之外，对于乳蛋白的结构和性质都有重要的影响，而在膜分离的过程中由于离子体积很小，理论上将在膜的两边自由扩散使得膜两边的离子浓度相同，但是由于截留液和透过液的蛋白质浓度不同，使得截留液和透过液各蛋白质所处的离子浓度不同[26-28]。

实验在50 ℃的温度下进行，分别使用0.08，0.11，0.14 M Pa 3 种跨膜压力下进行分离，待实验过程稳定后（约45 min）分别取脱脂奶，截留液，透过液检测样品离子浓度，实验过程无法使用同一批次的脱脂乳全部完成，不同实验批次之间脱脂乳理化指标存在差异导致金属离子含量最终检测结果不同，实验统一将金属离子含量换算为每克蛋白质金属离子含量以增加实验结果的可靠性，结果如表2 所示。

表2 4 种金属离子在截留液和透过液中的分布情况

牛奶中的70%左右的钙离子分布于在酪蛋白胶束中，30%左右钙离子处于游离的状态，所以大部分的钙离子都在截留液中。截留液每克蛋白质对应的钙离子浓度与脱脂奶原料的浓度相差不大，处于正常的浓度范围不会对酪蛋白胶束形态有影响。透过液中的每克蛋白质对应的钙离子浓度显著大于脱脂奶中每克蛋白质对应的钙离子浓度，此时透过液中的蛋白质主要为乳清蛋白，受钙离子浓度影响较小。

总体上整体离子浓度层面，检测的一价离子在截留液和透过液中的分布相对较为平均，透过液中的钾离子比截留液中的钾离子高30 %左右，截留液中的钠离子比透过液中的钠离子高70 %左右。而二价的金属离子则多分布于截留液中，钙离子原因如上所述，镁离子可以和磷酸根形成磷酸盐化合物，同时部分镁离子还可以和酪蛋白胶束结合，所以多数镁离子存在于截留液中。

从每克蛋白质对应的离子浓度层面，截留液中的酪蛋白所处的离子浓度低于分离前的环境。同时，透过液中每克蛋白质对应的离子浓度则远大于正常的脱脂奶，尽管透过液中的乳清蛋白往往对于金属离子不敏感，不会对其结构产生影响，但是在后续的处理或实验中，如浓缩制粉或复配使用过程中往往会带入大量的金属离子，所以需要对微滤分离的透过液进行脱盐处理。

3 结 论

研究了0.1 μm 陶瓷微滤膜连续在线加水洗滤从脱脂奶中分离乳清蛋白的工艺。受实验设备的限制，以往研究多集中于批次式的加工工艺，较难符合工业生产的需求，同时难以获得组分随制备时间的变化情况。相较于批次式生产工艺，连续式生产工艺拥有产量高、品质稳定及洗滤用水少等优势。但由于生产过程为连续动态更易受到膜表面污堵沉积带来的影响，分离的各组分浓度和组成会随着工作时间的延长发生变化。实验使用一级浓缩分离，二级、三级洗滤分离的分离模式，整体的膜通量随工作时间的延长而逐渐降低，通过数据分析发现膜通量的主要下降原因是由于一级膜通量下降导致，所以为延长工作时间需要重点关注一级膜的污堵情况。跨膜压力是影响微滤膜分离的重要因素，更高的跨膜压力可以产生更高的膜通量，提高分离效率，但是高跨膜压力同时可能带来更快更严重的膜堵情况，实验发现跨膜压力升高0.06 M Pa，膜通量可以提高26 %同时实验结束后的水洗恢复率将下降28 %左右。在跨膜压力一定的情况下，实验时间增加截留液中的乳清蛋白含量会逐渐增加，意味着透过液中的乳清蛋白含量会逐渐减小，整体的分离效率会下降，需要平衡生产时间与分离效率之间的关系。随着跨膜压力的升高α-La 分离率变化较小，但是β-LG 分离率显著升高。跨膜压力会显著地影响分离乳清蛋白的组成，可以根据生产需求和后续实验的要求利用跨膜压力对于乳清蛋白的组成比例进行调整。同时还研究了不同跨膜压力下的截留液和透过液的金属离子浓度，由于金属离子对蛋白质结构和功能有影响所以需要重点关注蛋白质所处的离子环境。