基于网络药理学研究抵当芪桂汤治疗糖尿病周围神经病变的潜在机制

张 潇， 杨景锋， 陈丽名， 李小会， 屈 杰

（陕西中医药大学伤寒金匮教研室，咸阳 712046）

全球成年糖尿病患者达到5.37 亿例，约有670 万人死于糖尿病和糖尿病并发症[1]。随着糖尿病病程的延长，患者出现糖尿病微血管病变的概率逐步升高，其中糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是主要表现之一[2]，发生在约50%的糖尿病患者中[3]。DPN 临床以远端对称多发性感觉运动神经病变最为常见，且有25%的患者有痛觉异常，但目前关于疼痛感产生的机理尚未完全明确[4]。DPN 的发病率高，早期症状不明显，严重者可造成不可逆的神经损伤，是糖尿病患者致残的主要原因之一[5]。

目前，现代医学多以控制血糖、改善微循环、营养神经、抗氧化等药物治疗DPN，但存在较多不良反应且长期疗效表现不佳[6]。中医药治疗DPN 有一定的优势，中医认为DPN 属于“消渴变证”，根据其临床表现可归于痹症、血痹等范畴[7]。其发病机制之一为气虚血瘀，治疗以益气养血、活血化瘀为主[8]。抵当芪桂汤是杨景锋教授基于张仲景《伤寒杂病论》两首著名方剂（黄芪桂枝五物汤、抵当汤）化裁而来，组方为生黄芪、桂枝、炒白芍、酒大黄、鬼箭羽、水蛭，具有通络降糖、益气化瘀的作用[9]。杨景锋等[10]通过常规剂量抵当芪桂汤治疗2 型糖尿病模型大鼠发现，其可以降低空腹血糖与血清游离脂肪酸（serum free fatty acid，FFA）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）含量，升高血清中脂联素（adiponectin，ADPN）含量，进而降低“糖脂毒性”，保护胰岛β 细胞结构。韩思荣等[11]研究发现，抵当芪桂汤治疗2 型糖尿病大鼠能够有效降低其血糖水平，保护胰岛细胞，上调胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表达，下调糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的水平。本研究利用网络药理学从靶点基因层面探索抵当芪桂汤治疗DPN 的作用机制，以期为临床提供中药治疗DPN 的客观依据。

1 资料与方法

1.1 相关数据库的建立

TCMSP（https：//tcmsp.php），HERB（http：//herb.ac.cn/），UniProt（https：//www.uniprot.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/），PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/），DrugBank（https：//www.drugbank.com/），OMIM（https：//omim.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

1.2 抵当芪桂汤活性成分与相应靶点的筛选

利用数据库TCMSP 得到黄芪、桂枝、白芍、大黄、鬼箭羽的活性成分，设筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-like，DL）≥0.18。利用数据库HERB得到水蛭的活性成分（此数据库无OB、DL 阈值）。将获得的潜在活性成分，使用UniProt 数据库下载限制为Human 的相关基因数据，对抵当芪桂汤的成分和靶点进行整合及转换基因名称。

1.3 抵当芪桂汤治疗DPN 的相关疾病靶点

使用GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank、OMIM 数据库，以“Diabetic Peripheral Neuropathy”为检索词查找相关的疾病靶点。将药物靶点和疾病靶点取交集，得到交集靶点。

1.4 药物—成分—靶点网络图的构建

对药物活性成分、靶点和疾病交集靶点进行数据处理整合，并导入软件Cytoscape 3.7.2 构建“药物—成分—靶点”相互作用网络。利用Cytoscape 软件的NetworkAnalyzer 工作计算网络拓扑参数。

1.5 靶点蛋白互作网络（PPI）的构建及核心靶点的筛选

将获得的药物—疾病交集靶点导入STRING数据库，限定物种为“Homo Sapiens”进行检索，运用Cytoscape 软件中“CytoNCA”功能进行网络的拓扑属性分析，根据其度值明确靶点间作用关系，进行两次核心靶点筛选，得到其核心靶点。

1.6 KEGG 通路富集分析和GO 富集分析

通过R 语言软件把药物—疾病靶点数据转换成基因序列号（ID），再进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析和基因本体（GO）富集分析。

1.7 活性成分—蛋白受体的分子对接

运用PubChem 数据库和Chem3D 软件获取药物活性成分3D 结构并最小化处理；运用UniProt 数据库和PDB 数据库获取靶点的蛋白结构。运用AutoDock 软件进行加氢和脱水等处理，再通过PyMOL 软件进行对接可视化。

2 结果

2.1 抵当芪桂汤治疗DPN 的相关疾病靶点

通过数据库TCMSP 检索抵当芪桂汤药物的活性成分为白芍10 个、大黄16 个、鬼箭羽8 个、桂枝7 个、黄芪20 个，通过数据库HERB 得到水蛭的活性成分59 个（表1、表2）。剔除重复值后获得药物成分靶点共923 个。

表1 抵当芪桂汤中的有效成分（药材）

2.2 抵当芪桂汤治疗DPN 的关键靶点

通过GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD 和DrugBank 数据库得到DPN 的疾病靶点，剔除重复值后获得1 736 个，见图1。疾病靶点与药物靶点取交集得到214 个共同靶点，即抵当芪桂汤所含药物治疗DPN 的潜在作用靶点，见图2。

图1 DPN 疾病靶点

图2 抵当芪桂汤药物靶点与DPN 靶点交集

2.3 抵当芪桂汤治疗DPN 的药物—成分—靶点相互作用网络

对药物活性成分、靶点和疾病靶点进行数据整合，并导入Cytoscape 3.7.2 构建抵当芪桂汤治疗DPN 的“药物—成分—靶点”相互作用网络图，见图3。网络图包括263 个节点（node），930 条边（edge）。其中药物活性成分排名前10 的是槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕榈酸（palmitic acid）。

图3 药物—成分—靶点网络图

2.4 抵当芪桂汤治疗DPN 的PPI 网络分析

通过STRING 数据库和CytoNCA 插件，以置信度为0.900 分析得到靶点的PPI 网络图，图中共有181 个节点、452 条边，见图4。运用CytoNCA插件获取PPI 网络核心，依据靶点节点度值的平均值进行筛选，最终筛选得到SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、TP53 和EP300等为核心靶点，见图5。这些靶点在PPI 网络中起连接作用，与抵当芪桂汤的有效活性成分作用的发挥有着紧密的关系，可能成为治疗DPN 的核心靶点。

图4 抵当芪桂汤治疗DPN 靶点PPI 网络图

图5 抵当芪桂汤治疗DPN 的核心靶点图

2.5 生物过程注释及代谢通路分析

2.5.1 抵当芪桂汤治疗DPN 关键靶点GO 富集分析 通过R 语言软件以P<0.05 进行筛选，排名前10 位的以GO 富集分析柱状图展示，见图6。关键靶点涉及对脂多糖的反应、细胞对化学压力的反应、MAPK 级联正调控、氧化应激反应、对外源性刺激的反应、激酶活性的正向调节、调节体液水平、对氧气水平的反应、对氧含量下降的反应，以及应对缺氧、对活性氧反应等生物过程，主要集中在膜筏、膜微区、囊腔，分泌颗粒管腔、胞质囊泡腔、质膜外侧、内吞囊泡和黏着斑等部位，涉及DNA 结合转录因素绑定、细胞因子受体结合及RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶绑定、核受体的活性、配体激活的转录因子活性、激素绑定等分子功能。

2.5.2 抵当芪桂汤治疗DPN 关键靶点KEGG 通路富集分析 通过R 语言软件以P<0.05 进行筛选，排名前30 位的以KEGG 通路富集分析气泡图展示，见图7。关键靶点涉及PI3K-AKT 信号通路、脂质和动脉粥样硬化、MAPK 信号通路、AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症、内分泌抵抗、HIF-1 信号通路等相关通路。

图7 KEGG 通路富集分析气泡图

2.6 活性成分—蛋白受体的分子对接

通过PubChem 数据库获取核心药物活性成分结构并用Chem3D 软件处理，运用PDB 数据库和UniProt 数据库获取基因靶点蛋白结构。选取核心基因靶点SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300，与药物活性成分槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、酪氨酸（tyrosine）、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）进行分子对接。一般结合能≤-20.93 kJ·mol-1表示结合作用较好，≤-29.3 kJ·mol-1表示结合作用较强。对接结果见图8，以对接结果排名前5为例进行部分可视化展示，见图9。

图8 分子对接结合键能热图

图9 活性成分与关键靶点分子对接图

3 讨论

DPN 的发病机制较为复杂，受多个基因及多条信号通路的调控。高血糖、脂代谢异常及胰岛素抵抗等因素会诱发代谢通路的异常，如多元醇通路、蛋白激酶C 通路等；同时也导致代谢产物的异常，如改变细胞内线粒体的稳态，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基及糖基化终产物积聚等；而代谢通路和代谢产物的异常引起细胞内氧化应激反应，导致炎症产生的同时也会激活异常代谢通路，最终导致神经受损[12]。DPN属于中医痿证、痹症、不仁等范畴，其病机分为气虚血瘀和痰瘀互结等[13]。本研究中抵当芪桂汤君药以黄芪补脾肺肾，益气以行血；臣药以桂枝温通经脉；佐以白芍养阴生津，补肝体以助肝用，使肝能疏泄以助脾之运化；鬼箭羽、水蛭、大黄三药并使，化瘀通络兼祛湿浊[14]。诸药合用，具有益气化瘀、气血同调、标本兼治之功。针对气虚血瘀的DPN 患者[9]，杨景锋教授认为2 型糖尿病周围神经病变的基本病机为气虚血瘀，抵当芪桂汤切中此病病机，临床运用此方加减治疗糖尿病及其并发症效果较好[15]。

网络药理是通过大数据进行药物分析的新模式，通过网络药理学方法预测抵当芪桂汤治疗的靶点，可为抵当芪桂汤治疗DPN 的研究提供一定的理论依据。本研究除水蛭外，其余中药均以OB≥30%、DL≥0.18 的阈值为标准筛选活性成分，未达到阈值标准的活性成分未纳入本次研究中。其中筛选得到抵当芪桂汤活性化合物123个，预测药物活性成分与DPN 的潜在共同靶点214 个。网络图提示抵当芪桂汤治疗DPN 的有效化合物为槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕榈酸（palmitic acid）等。

山柰酚是一种黄酮类化合物，它及其衍生物具有抗炎、抗氧化和抗抑郁等作用，其中它对神经的保护作用受到广泛关注[16]。山柰酚可以抑制炎症细胞因子表达和ROS 的产生，也可通过调节氧化和亚硝化应激及抑制AGE-RAGE 的激活改善疼痛反应，具有抗糖尿病，改善糖尿病神经疼痛的作用[17]。熊果酸是一种五环三萜类化合物，可以通过抗氧化和抗炎对抗神经功能障碍，也可以降低蛋白酪氨酸磷酸酶1B，使胰岛素受体磷酸化，从而诱导葡萄糖吸收[18]。熊果酸可以通过抗氧化和抗炎作用改善糖尿病的多种并发症[19]。槲皮素是自然界的一种黄酮类化合物，同样具有较强的抗炎、抗氧化、保护心血管、抗肿瘤的作用[20]。槲皮素能改善DPN 模型大鼠坐骨神经中髓鞘中的脱髓鞘，纠正轴突萎缩，且增加了DPN模型大鼠中背根神经节（DRG）神经元，对高糖诱导的周围神经病变具有神经保护作用[21]。肝素是一种糖胺聚糖药物，与多种蛋白结合后可以发挥抗炎、抗凝、抗肿瘤等作用[22]。有实验研究[23]发现，基于肝素的水凝胶，可以更有效、安全地递送神经营养因子［神经生长因子（NGF）和bFDF］共同到达坐骨神经损伤的糖尿病大鼠中以增强受损的坐骨神经髓鞘再生；轴突生长，出现周围神经再生。

本研究的关键靶点蛋白有MAPK14、MAPK1、AKT1、ESR1、SRC、EGFR、FOXO3、JUN、CTNNB1、IL6、TP53、STAT3、PIK3CA、EP300、MAPK3 和FOS。根据度值得到排名前10 的核心靶点为SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300。丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3，MAPK3）是MAP 激酶家族的一员，也被称为细胞外信号调节激酶（ERK）1，MAPK3 参与多种细胞过程，包括增殖、炎症和细胞代谢等，当肝脏在空腹期间通过分解糖原和糖异生将葡萄糖释放到循环中时，MAPK3 在维持葡萄糖稳态中起主要作用[24]。STAT3 是信号转导和转录激活因子3。通过检测神经损伤诱导神经疼痛性大鼠模型的背根神经发现，Janus 激酶2（JAK2）/STAT3 表达上调，磷酸化的STAT3 和JAK2 表达增强，且通过电针抑制背根神经中的JAK2/STAT3 信号传导后，神经损伤诱发的神经疼痛缓解[25]。肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）可诱导凋亡调节因子和糖酵解转换途径，降低ROS 水平，维持细胞内氧还原，增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），调节细胞内葡萄糖代谢[26]。研究[27]表明，TP53 在受损的神经元中表达是升高的，但它的缺失可以抑制神经元的凋亡。

GO 富集结果显示，抵当芪桂汤中的药物作用于DPN 的靶点主要涉及DNA 结合转录因素绑定、细胞因子受体结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合等分子功能，其作用主要集中在膜筏、膜微区、囊腔，分泌颗粒管腔、胞质囊泡腔、质膜外侧等部位，在对脂多糖的反应、细胞对化学压力的反应、MAPK 级联正调控、氧化应激反应、对外源性刺激的反应等生物过程中发挥作用。

KEGG 通路富集结果提示，抵当芪桂汤的作用靶点主要集中在PI3K-AKT 信号通路、MAPK信号通路、AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症、内分泌抵抗和HIF-1 信号通路等。AGERAGE 信号通路的传导导致NADPH、氧化酶、MAPK、蛋白激酶C 等多个细胞内信号通路激活，促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、Il-1β等多种促炎细胞因子的表达，导致外周神经元节段性脱髓鞘[28]。实验研究[29]表明，通过抑制AGERAGE 减少氧化应激，减少磷酸化的NF-κB，可以改善动物机械负荷引起的疼痛阈值，在动物坐骨神经切片下观察到，受药物抑制AGE－RAGE信号治疗的髓鞘神经纤维受损伤程度小。PI3KAKT 信号通路参与多个生物过程，包括细胞增殖、细胞凋亡、葡萄糖代谢等[30]，它的激活传导促进了糖尿病大鼠背根神经节神经元的神经突生长[31]。MAPK 信号通路被激活作为很多信号通路传导的反应，且有研究调查MAPK 信号通路参与炎症反应，通过细胞实验研究发现抑制MAPK 途径可以使脂多糖诱导的RAW264.7 巨噬细胞中磷酸化的P38 和ERK 下调，达到抗炎的作用[32]。因此，抵当芪桂汤的有效成分可以通过调控多个信号通路，参与多个生物过程，发挥治疗DPN 的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学方法预测了抵当芪桂汤治疗DPN 的化学成分、作用靶点及信号通路，体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的特点。然而，网络药理学存在一定局限性，在抵当芪桂汤实际药效、毒理性、量效关系等方面还需相关实验研究加以验证。