基于转录组测序的煤工尘肺大鼠模型中线粒体相关差异基因筛选及分析

刘道伟， 张 娜， 刘琭璐， 章 梅， 杨惠芳

（1.宁夏医科大学公共卫生学院，银川 750004； 2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

尘肺病是在职业活动中长期吸入不同致病性的生产性粉尘，并在肺内潴留而引起的，以肺组织弥漫性纤维化为主的一组职业性肺部疾病的统称[1]。目前，尘肺病是我国发病人数最多、危害最严重的职业病，包括矽肺和煤工尘肺[2]。虽然近几年我国尘肺病的新发病例数呈下降趋势，但尘肺病给我国职业人群造成的危害仍然不可忽视[3]。在尘肺发病机制的复杂炎性网络中，线粒体的致病作用越来越受到大家的重视。线粒体是细胞内氧化磷酸化的场所，为细胞生命活动提供能量、生成ATP 的同时，生成副产物活性氧，还具有调节细胞凋亡、内容物致炎等多种作用[4]。因此，粉尘引起的肺组织线粒体功能障碍可能是尘肺纤维化的重要发病机制之一。本研究拟在建立大鼠尘肺纤维化模型的前提下，利用转录组测序技术筛选出尘肺病发生和发展过程中与线粒体有关的重要基因，并进行生物信息学分析，以期为后续研究尘肺病的分子机制提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级7～8 周龄雄性SD 大鼠30 只，体质量200～220 g，购自宁夏医科大学实验动物中心。实验动物饲养于（25±2）℃，空气湿度50%～60%，12 h 明暗交替环境中，自由饮水、摄食，统一进食标准，适应性饲养1 周后开始进行实验。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.2 材料和试剂

煤尘（宁夏煤矿矿井内回风巷降尘）；二氧化硅标准品（美国Sigma-Aldrich 公司）；乙醚（东莞市化学试剂有限公司）；4%多聚甲醛（兰杰科技有限公司）；苏木素（北京索莱宝科技有限公司）；伊红（北京索莱宝科技有限公司）；Wiegert 铁苏木素（上海双简生物科技有限公司）；丽春红酸性品红（上海士锋生物科技有限公司）；磷钼酸［阿拉丁试剂（上海）有限公司］；苯胺蓝（南京化学试剂股份有限公司）；辣根过氧化物酶标记链霉菌抗生物素蛋白溶液（杭州纽龙生物科技有限公司）；DAB 染色液（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 主要仪器

石蜡切片机、低温高速离心机（德国Rjung Heidelberg 公司）；洁净工作台（力康生物医疗科技控股有限公司）；精密电子天平（宁波金诺天平仪器有限公司）。

1.4 粉尘悬溶液制备

为配制悬浊液50 mg·mL-1，分别称取1.75 g二氧化硅与煤尘于两支50 mL 玻璃瓶中，再各加入生理盐水35 mL，充分混匀，封口后在121 ℃高压蒸汽锅内消毒20 min，4 ℃保存备用。

1.5 分组和造模

根据随机数表法将大鼠分为3 组，即对照组、煤尘组、矽尘组，每组10 只。采用一次性非气管暴露法对煤尘组与矽尘组大鼠于气管内分别注入1 mL 已配制好的煤尘和二氧化硅粉尘悬液，对照组以等量的灭菌生理盐水代替。

1.6 肺组织病理学检查

大鼠造模完成后于同一环境下饲养至90 d，乙醚麻醉后，心尖采血处死。迅速取出完整的肺组织，观察大体形态并拍照。取左肺叶置于甲醛中，用于常规脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE染色和Masson 染色，通过免疫组化检测胶原蛋白Ⅰ（COL-Ⅰ）表达水平。将右肺叶保存于液氮中，用于转录组测序实验。

1.7 高通量测序

1.7.1 转录组测序步骤 对大鼠右肺叶样本进行总RNA 提取与质检，经mRNA 富集、双链cDNA 合成、PCR 富集与文库纯化与库检后，开展高通量Illumina 测序分析。测序部分委托北京百迈客生物科技有限公司完成。使用Illumina HiSeq平台对cDNA 文库进行测序得到大量raw reads，过滤后得到原始数据（clean date），与参考基因组比对，得到mapped data。

1.7.2 基因功能分析与差异表达基因筛选 测序得到各组样本的校正基因表达量后，进行基因的差异表达定量分析。对对照组与煤尘组、对照组与矽尘组两两进行分析，基因差异表达显著水平与倍数，使用FDR（false discovery rate）进行可信度检验。在差异表达基因检测过程中，将（上、下调差异倍数≥1.5）且FDR＜0.05 作为筛选标准。根据基因在不同样品中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等表达水平分析。

1.8 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD－t法。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学观察

通过对各组肺组织形态、肺组织切片染色（HE 染色、Masson 染色）和免疫组化COL-Ⅰ表达水平的观察，发现煤尘组与矽尘组病理改变明显且纤维化程度升高，出现了肺纤维化的典型特征，见图1 至图4。

图1 大鼠肺组织形态学

图2 大鼠肺组织HE 染色

图3 大鼠肺组织Masson 染色

图4 大鼠肺组织免疫组化实验

2.2 序列比对分析

将质量控制后的clean reads 与参考基因组比对，12 个样本比对到参考基因组上的reads 数目及在clean reads 中超过93.91%；比对到参考基因组唯一位置的reads 数目及在clean reads 中超过86.29%；比对到参考基因组多处位置的reads 数目及在clean reads 中低于8.11%。结果表明，转录组测序的结果具有较高的覆盖度和均匀性。

2.3 基因的差异表达分析

在对照组与煤尘组中，1 246 个基因存在显著性差异（上调913 个和下调333 个）；在对照组与矽尘组中，5 462 个基因存在显著性差异（上调2 796 个和下调2 666 个），见图5。根据测序数据中的FPKM 值生成差异基因火山图和聚类热图，见图6。

图5 差异表达基因图

2.4 GO 与KEGG 富集分析

对对照组与煤尘组、对照组与矽尘组样本进行GO 富集分析，得到差异基因在GO term 上的分布情况，包括分子功能、生物过程、细胞组分。

对照组与煤尘组、对照组与矽尘组的差异基因均主要集中于生物调节、刺激反应、催化活性、细胞部分、单一的生物过程、细胞等功能上。对照组与煤尘组的差异基因富集在前20 条通路上，其中在类风湿关节炎、吞噬体、结核、细胞因子-细胞因子受体相互作用等显著通路富集的差异基因最多。对照组与矽尘组的差异基因富集在前20条通路上，其中在癌症的途径、吞噬体、朊病毒病、结核等显著通路富集的差异基因最多，见图7。

图7 差异基因GO 注释分析和KEGG 富集分析

2.5 与线粒体有关的差异基因

对对照组与煤尘组中的差异基因进行筛选，与线粒体有关的差异基因Bcl2a1、Scimp、Arg2、Mmp9、Sod2 等，共35 个（28 个上调，7 个下调），对照组与煤尘组中相关差异基因较少。

对照组与矽尘组相比，和线粒体有关的差异基因Mmp9、Trem2、Akr1b8、Acod1、Ptcd3 等一共302 个（202 个上调，100 个下调）。通过GO 富集分析发现，在生物过程中，细胞过程、单一的有机体过程较为重要。在细胞组分中，以细胞部分、细胞为主。在分子功能中，以催化活性、活动分子传感器为主。在对照组与矽尘组中，与线粒体相关的差异基因通过KEGG 显著富集到的前20 条通路，包括精氨酸生物合成、丙酮酸代谢、军团菌病、细胞凋亡、柠檬酸循环（TCA 循环）、氧代羧酸代谢、心肌收缩、p53 信号通路、氨基酸的生物合成、朊病毒病、细胞凋亡、逆行内源性大麻素信号、碳代谢、非酒精性脂肪肝病、氧化磷酸化、帕金森综合征、亨廷顿病、产热、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化。其中，氧化磷酸化、产热、帕金森综合征、朊病毒病等通路富集的与线粒体相关的差异基因最多，见图8。

图8 与线粒体相关差异基因GO 注释分析和KEGG 富集分析

3 讨论

煤工尘肺的发生、发展是一个复杂的过程，从单一基因或单一通路探究疾病的发生和发展因素、寻求治疗靶点是片面且困难的，所以筛选分析差异表达基因十分重要[5]。

本研究采用一次性非暴露式气管内灌注法对大鼠进行染尘实验，成功建立大鼠肺组织纤维化模型。通过肺组织形态学观察与HE 染色、Masson 染色等观察，确立大鼠纤维化病理切片特征。结果显示，与对照组相比，煤尘组大鼠的肺组织表面观察到大量煤斑，呈灶状、境界不清、色黑、质软，存在少量陈旧性的出血点；HE 染色切片中正常固有结构消失，大部分的肺泡间隔消失，肺间质镜下充满纤维化增生，有毛细血管扩张充血，炎性细胞浸润于肺泡中，有的肺泡腔内充满被煤尘侵蚀的细胞，煤斑增大融合，局部气腔扩大。矽尘组大鼠的肺组织表面可见弥漫性粟粒状结节，结节隆起于肺表面，质地较硬，肺表面有囊肿，并有融合病灶、散在陈旧性出血点；HE染色切片观察到典型的矽结节由已发生玻璃样变的胶原纤维构成，肺固有结构消失，肺泡结构不存在，肺组织内可见弥漫性纤维化病灶。Masson 染色切片中，煤尘组、矽肺组的胶原纤维程度均高于对照组。通过免疫组化对大鼠肺组织切片进行COL-Ⅰ表达水平的测定显示，煤尘组、矽肺组的COL-Ⅰ表达水平均高于对照组。

高通量转录组测序技术在挖掘差异表达基因、揭示生物基因表达及调控机制中发挥了重要作用[6-7]。通过高通量转录组测序方式筛选出3 组大鼠的肺组织样本的差异表达基因，并从中找出与线粒体有关的差异表达基因进行生物信息学分析。通过GO 富集分析发现煤尘组和矽尘组分别与对照组相比，在生物过程中，以细胞过程、单一的有机体过程较为重要；在分子功能中，以活动分子传感器、催化活性为主；在细胞组分中，以细胞部分、细胞为主。

KEGG 代谢通路注释结果表明，对照组与矽尘组中与线粒体相关的差异基因富集到的通路中，氧化磷酸化、产热、帕金森综合征、朊病毒病等通路富集的基因最多。煤工尘肺中与线粒体相关的差异基因，如Mmp9，有研究结果[8]表明，Mmp9 是一种新的线粒体功能障碍生物标志物，同时能激活生长因子，促进上皮下成纤维细胞增殖和活化，导致胶原纤维大量增生。

综上所述，本研究通过转录组测序技术筛选出煤工尘肺中与线粒体相关差异基因和通路，这些差异基因可能成为煤工尘肺的基因治疗靶点，为进一步解析探索煤工尘肺与线粒体的关系提供依据。