TFAP2A 基因重组真核表达载体的构建及鉴定

郭宇琪， 王亚丽， 张智源， 高玉婧

（1.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川 750004； 2.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，银川 750004）

转录因子增强子结合蛋白-2α（transcription factor activating enhancer binding protein 2 alpha，TFAP2A） 是转录因子AP-2 家族的成员之一。AP-2 家族由AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ 和AP-2ε 组成，通过与靶基因的启动子区域结合，调控参与细胞周期、细胞增殖、凋亡的众多基因的转录，在哺乳动物发育过程中起到重要作用。TFAP2A 基因缺失可导致鳃裂眼面综合征（branchio-oculo-facial syndrome，BOFS）。目前已发现该基因编码不同亚型的三种转录变体。TFAP2A与多种肿瘤的发生和发展密切相关。研究[1]发现，miR-876-5p 通过靶向TFAP2A 抑制乳腺癌发展；锌指蛋白ZNF471 通过转录抑制下游靶点TFAP2A 和PLS3 抑制胃癌发生[2]；TFAP2A 通过反式激活PSG9 来增强TGF-β 信号传导，从而促进肺腺癌转移[3]；TFAP2A 通过与PDL1 形成的正反馈通路促进宫颈癌的发生[4]。为深入研究TFAP2A 在肿瘤发生发展中的作用和机制，本研究构建了TFAP2A 的真核表达载体并对其表达效率进行了检测，为后续研究奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和细胞 大肠杆菌DH5α 感受态为本实验室制备。CV702 质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。MDA-MB-231 细胞为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamH I 和HindIII 购自英国New England Biolabs 公司；RPMI 1640 培养基购自美国Biological Industries 公司；Lipofectanmine 2000 购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；ClonExpressTMⅡOne Step Cloning Kit 购自Vazyme 公司；GAPDH 抗体购自美国proteintech 公司；Flag 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；TFAP2A 抗体购自美国abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获取 通过PCR 扩增制备TFAP2A 的cDNA 片段，设计引物序列如下：TFAP2A-F：5’-CACACTGGACTAGTGGATCCCGCC ACCATGAAAATGCTTTGGAAATTG-3’；TFAP2AR：5’-CCTTGTAGTCACTTAAGCTCTTTCTGTGCT TCTCCTCTTTGTC-3’。扩增引物除含有目的基因5’端部分序列用于PCR 扩增目的基因外，还包含BamH I 和Hind III 的酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应条件为98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环，最后72 ℃延伸8 min。

1.2.2 目的基因与载体的连接及转化 采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对CV702 质粒的多克隆位点进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。将PCR 扩增产物与载体进行连接，于冰上配置反应体系，见表1。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。将反应液置于37 ℃反应30 min，随后置于冰上冷却5 min 后立即转化。将10 μL 反应产物加入到100 μL 感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。42 ℃热激90 s，冰上放置2 min。加入LB 培养基500 μL，置于37℃摇床振荡培养1 h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12～16 h。

表1 PCR 产物与载体进行连接反应体系（μL）

1.2.3 菌落PCR 法鉴定CV702-TFAP2A 重组质粒 对菌落进行PCR 鉴定，鉴定引物序列为TFAP2A-KL-F：5’-TAACAAGGACAACCTCTTCG-3’；TFAP2A-KL-R：5’-TTATTAGGAAAGGACAGT GGG-3’。在超净工作台中，用无菌枪头挑取单个菌落至20 μL 鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。反应条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共22 个循环，最后72 ℃延伸5 min。将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养12～16 h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。

1.2.4 CV702-TFAP2A 转染细胞及表达效率的检测 将MDA-MB-231 细胞适量接种于六孔板中，用含有10% FBS 的RPMI 1640 培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞汇合率约为60%～70%时，使用Lipofectanmine 2000 将1 μg 的CV702载体和CV702-TFAP2A 重组载体分别转染至MDA-MB-231 细胞中。于转染后48 h 提取各组细胞总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，200 mA 湿转150 min 至PVDF 膜后，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，5%脱脂奶粉稀释兔抗人Flag 抗体、TFAP2A 抗体以及GAPDH 抗体，4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育50 min，TBST洗膜3 次，每次5 min，显影曝光，保存实验结果，并用Image J 软件进行灰度值定量。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 23.0 统计学软件和Graph-Pad Prism 10.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CV702-TFAP2A 重组真核表达载体的构建

根据CV702 质粒图谱（图1），采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对质粒进行双酶切，以形成相应的黏性末端，见图1。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。采用凝胶回收试剂盒回收线性化的载体条带。TFAP2A cDNA全长为1 320 bp，对TFAP2A 进行PCR 扩增，PCR 产物电泳结果见图3，将PCR 扩增产物与线性化表达载体进行连接，得到重组产物，并转化入大肠杆菌DH5α 中，获得重组细菌克隆。

图1 CV702 载体结构示意图

图2 CV702 载体酶切结果

图3 PCR 扩增结果

2.2 CV702-TFAP2A 重组真核表达载体的鉴定

挑取8 个转化子克隆，以TFAP2A 基因引物进行PCR 扩增及鉴定，结果见图4，转化子2、3、5、6、7、8 均能够扩增出TFAP2A 基因，提示为阳性克隆。对阳性克隆进一步进行测序及分析，见图5，对比结果表明测序结果与TFAP2A cDNA序列完全一致，表明CV702-TFAP2A 重组真核表达载体构建成功。

图4 PCR 鉴定重组克隆

图5 阳性克隆测序峰图

2.3 CV702-TFAP2A 在MDA-MB-231 中的表达鉴定

分别采用TFAP2A 抗体和Flag 抗体进行检测，结果见图6，与CV702 对照载体相比较，转染CV702-TFAP2A 重组质粒的MDA-MB-231 细胞中的Flag-TFAP2A 的表达水平升高（P 均<0.05），表明所构建的CV702-TFAP2A 重组载体能够在真核细胞中高效表达。

图6 CV702-TFAP2A 在MDA-MB-231 中的表达鉴定

3 讨论

世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020 年统计数据显示，女性乳腺癌现在已经超过肺癌成为2020 年全球癌症发病率的主要原因[5]。在所有乳腺癌病理类型中，三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）仅占10%～20.8%，患者预后极差。三阴性乳腺癌是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子（HER-2）均表达为阴性的乳腺癌[6]。TNBC 患者的发病年龄比其他类型乳腺癌患者更年轻，通过117 例TNBC 患者的分析，结果显示63%的TNBC 患者年龄小于50 岁[7]。目前TNBC 的主要治疗方法是肿瘤切除和化疗，但由于其分子异质性、细胞分化差、恶性程度高、缺乏分子靶点、转移速率快，目前尚无预防TNBC 复发的靶向治疗方法[8]。因此还需要更多的基础研究和临床研究来改善TNBC 的治疗。

TFAP2A 基因定位于6 号染色体短臂，包含7 个外显子，大部分变异位点位于4 号外显子上，占82%。转录因子TFAP2A 作为AP-2 家族成员，参与细胞生长、增殖和分化的调控，参与胚胎形成过程中的程序性死亡[9]；增强肿瘤细胞对靶向药物的敏感性[10]；在肿瘤中发挥双向调控作用：在乳腺癌、肺癌、胃癌等中发挥促癌作用[11-13]，在黑色素瘤、结直肠癌、肝癌中发挥抑癌作用[14-16]。近年来，有研究[17-18]表明，转录因子TFAP2A 可以促进乳腺癌的发生和发展，过表达TFAP2A 可促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[1]。敲低长链非编码RNA MAFG-AS1 通过miR-3196/TFAP2A轴使JAK2/STAT3 信号通路失活，阻断乳腺癌细胞的恶性进展[19]。TFAP2A 过表达可能是乳腺癌发生和发展的重要因素之一。另有研究[20]发现，与化疗敏感患者相比，化疗耐药的TNBC 患者中TFAP2A，TFAP2C 的表达更高，这意味着这些转录因子是TNBC 患者化疗耐药的关键贡献因子。但TFAP2A 在TNBC 迁移和侵袭中的具体机制尚不明确，还需进行深入研究。

本研究采用载体所带的Flag 融合标签进行了重组质粒表达效率的检测。融合标签是指利用DNA 体外重组技术，在目的蛋白N 端或C 端进行融合表达的特定蛋白、多肽或寡肽标签[21]。重组蛋白通过融合标签可与包被在固相基质上的特异配基结合，使重组蛋白定向固定并得以纯化，简化重组蛋白的检测[22-23]。同时，既能保留天然蛋白的大部分结构，又能实现增加溶解度、防降解、便于纯化等功能。常用的融合标签有Flag、HA、c-myc 等。其中Flag 融合标签是具有8 个氨基酸的短序列标签，大小为1.01 kDa。Flag 融合标签序列短，只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码通常不会影响目的蛋白的功能和性质[21，24]。Flag 标签融合蛋白可以直接通过非变性亲和层析纯化，从而得到有活性的融合蛋白。抗Flag 的抗体可以有效识别Flag 标签，可以通过ELISA、Western blot 等方法对含有Flag 的融合蛋白进行检测[21]。

综上所述，本研究采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对质粒进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在回收线性化载体条带后，PCR扩增TFAP2A，将扩增产物与线性化载体连接后导入大肠杆菌DH5α，完成真核表达载体的构建。再继续对重组真核表达载体CV702-TFAP2A进行鉴定，发现8 个转化子克隆中有6 个为可以扩增出TFAP2A 的阳性克隆，进一步测序及分析证明了重组真核表达载体CV702-TFAP2A 构建成功。通过在MDA-MB-231 细胞中转染CV702-TFAP2A 及其对照质粒，进行Western blot 实验，证实转染CV702-TFAP2A 的细胞中Flag -TFAP2A 的表达水平升高，为后续深入研究TFAP2A 在TNBC 发生和发展过程中尤其是侵袭和转移中的作用及分子机制奠定了研究基础。