邻苯二甲酸单丁酯通过Caspase-3/GSDME 通路诱导睾丸间质细胞焦亡

闫凤梅， 李 玲， 郝 羽， 黄 静， 撒开清， 王 硕

（1.宁夏医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学系，银川 750004； 2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川 750004）

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalic acid esters，PAEs）具有良好的可塑性和延展性，广泛用于塑料加工等行业[1]。PAEs 极易通过挥发、溶解和迁移等方式进入环境，最终经皮肤、呼吸道和消化道进入人体并对人体造成损害[2]。PAEs 的种类有很多，包括邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）等[3]。有研究[4]表明，DBP 可以破坏鳃的能量代谢和形态，诱导肝毒性。DBP 通过激活NOD2/RIP2/NF-κB 信号通路，引起草鱼肝细胞凋亡和炎性因子水平的升高[5]。当DBP 被人体吸收后，能水解成邻苯二甲酸单丁酯（monobutyl phthalate，MBP），MBP 具有多种毒性，对动物生殖和发育有一定的影响[6]。有研究[7]表明，MBP 对雄性青春期大鼠内分泌器官有一定的毒性作用。MBP 也可以通过TNF/IL6/STAT3 信号通路诱导小鼠睾丸间质细胞株（TM-3）细胞铁死亡[8]。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式，其发生通常与各种细胞死亡有关，如细胞凋亡和坏死。有研究[9-11]显示，Caspase-3/GSDME 通路可引起细胞焦亡，还可改变凋亡和焦亡之间的平衡[12]。本课题组前期研究结果表明，MBP 作用于睾丸间质细胞后会引起细胞凋亡[13]，一定剂量的MBP 可提高TM-3 细胞自噬水平[14]。因此，本研究以睾丸间质细胞为模型，以Caspase-3 介导的细胞焦亡为切入点，探讨MBP是否通过Caspase-3/GSDME 通路诱导睾丸间质细胞焦亡，为进一步研究MBP 致雄性生殖毒性的作用提供理论依据和研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要仪器与试剂

1.1.1 细胞株 小鼠睾丸间质细胞株（TM-3 细胞，美国ATCC 细胞研究中心）。

1.1.2 主要仪器 CO2培养箱、发光成像系统、净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司），细胞计数仪［康宁（上海）管理有限公司］，细胞成像系统倒置生物显微镜［爱可机械（深圳）有限公司］，高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），酶标仪（美国珀金埃尔默股份有限公司）。

1.1.3 试剂 MBP 标准品（纯度：99.85%，美国Medchem Express 公司），胎牛血清（美国Gibco公司），细胞凋亡与坏死试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒和Caspase-3 抑制剂（Ac-DEVD-CHO）（上海碧云天生物技术股份有限公司），CCK-8 细胞增殖检测试剂盒、全蛋白提取和BCA 蛋白检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），Caspase-3（ab184787）、GSDME（ab215191）、GSDME-N 抗体（ab222407）（英国Abcam 公司） 和cleaved-Caspase3 抗体（D160009）［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 TM-3 细胞培养、染毒液配制及分组

复苏TM-3，离心弃掉冻存液，加入新配制的完全培养基，于37 ℃、5% CO2、100%相对湿度培养箱中培养24 h 后换液传代，在对数生长期收集细胞。MBP 染毒液配制：准确称取适量的MBP粉末溶于无菌的二甲基亚砜（DMSO）中制成母液。按照本课题组前期实验剂量[8]，加入无菌培养基，梯度稀释成对照组（0 mmol·L-1）、低剂量组（2.5 mmol·L-1）、中剂量组（5 mmol·L-1）、高剂量组（10 mmol·L-1）的染毒液，现用现配。

1.3 CCK-8 法检测不同浓度Caspase-3 抑制剂对细胞活力的影响

调整细胞浓度，将细胞接种到96 孔板中，在CO2培养箱中培养到细胞贴壁后，加入浓度梯度为0（对照组）、2.5、5、10、20 μmol·L-1的抑制剂继续培养24 h，避光加入适量的检测液，37 ℃孵育，检测其吸光度值。

1.4 光学显微镜下观察TM-3 细胞形态

将TM-3 细胞接种到6 孔板中，待细胞铺满孔底70%～80%，分别加入0、2.5、5、10 mmol·L-1的MBP 干预24 h，于光学显微镜下观察细胞形态变化。

1.5 LDH 释放实验

取TM-3 悬液，将细胞接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，按照分组加入MBP 染毒液，放入培养箱中培养23 h 后，向样品最大酶活性孔加入LDH 释放试剂，继续于细胞培养箱中孵育。检测时各孔取120 μL 上清液，移至新的96 孔板中，各孔分别加入60 μL 配制好的LDH 检测工作液，室温下避光孵育30 min；采用酶标仪于490 nm处测定各孔光密度（OD）值。计算：LDH 释放率（%）=［（实验孔OD 值-对照孔OD 值）/（最大酶活性孔OD 值-对照孔OD 值）］×100%。

1.6 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色检测

各组细胞经不同药物干预24 h 后，向含有细胞的6 孔板中加入5 μL Hoechst 33342 和5 μL PI 染液，于4 ℃条件下避光孵育30 min，PBS 溶液漂洗后，使用倒置荧光显微镜拍照。随机选取3 个不同视野，计算每个视野中的细胞总数及红色荧光细胞数，计算PI 阳性细胞比例[15-16]。

1.7 Western blot 检测Caspase-3 和GSDME 蛋白变化

将适当浓度的细胞悬液接种于无菌培养皿内，混匀。待细胞长至70%～80% 时，用MBP 染毒，于培养箱中继续培养24 h，严格按照全蛋白提取试剂盒说明书操作，用BCA 法测蛋白浓度，配制合适的上样体系，变性。通过Western blot（制胶，上样，跑胶，转膜，剪膜，封闭，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜）检测Caspase-3 和GSDME 蛋白的表达量，并应用Image J 软件计算灰度值。

1.8 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 9 和SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度MBP 染毒对TM-3 细胞形态的影响

对照组TM-3 细胞大多为多边形，细胞间排列较密集。随着染毒剂量的增加，各细胞间的间隙变大，肿胀和球囊状冒泡的细胞增多，贴壁细胞的数量明显减少，见图1。

2.2 MBP 染毒对TM-3 细胞上清液中LDH 水平的影响

MBP 染毒细胞24 h 后，检测细胞上清液中的LDH 含量，与对照组相比，所有处理组细胞上清液中的LDH 水平均升高（P＜0.01），见图2。

图2 不同浓度MBP 对TM-3 细胞LDH 释放率的影响

2.3 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞活力的影响

CCK-8 法检测不同浓度Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞增殖的影响。随着Ac-DEVD-CHO 浓度的增加，TM-3 细胞的存活率出现先上升后下降的趋势，与对照组相比，5 μmol·L-1Ac-DEVDCHO 细胞存活率为99.17%（P＞0.05）。因此，选择5 μmol·L-1Ac-DEVD-CHO 作为抑制剂组干预剂量。进一步检测各处理组对细胞活性的影响，结果表明，与中剂量组相比，抑制剂组细胞存活率降低（P＜0.05），见图3。

图3 不同处理组染毒对TM-3 细胞活力的影响

2.4 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞上清液中LDH 水平的影响

不同分组处理细胞24 h 后，检测细胞上清中的LDH 含量，与对照组相比，所有处理组细胞上清液中的LDH 水平均升高（P＜0.05）。与中剂量组相比，中剂量+抑制剂组LDH 的释放率有所下降（P＜0.05），见图4。

图4 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞LDH 释放率的影响

2.5 MBP 染毒对TM-3 细胞PI 阳性比例的影响

经Hoechst 33342/PI 双染后结果显示，与对照组相比，各染毒组PI 阳性比例均升高（P 均＜0.05），见图5。

图5 不同浓度MBP 对TM-3 细胞PI 阳性比例的影响

2.6 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞PI 阳性比例的影响

与对照组相比，抑制剂组、中剂量组、中剂量+抑制剂组PI 阳性比例均升高（P 均＜0.05）。与中剂量组相比，中剂量+抑制剂组PI 阳性比例有所下降（P＜0.05），见图6。

图6 加入Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞PI 阳性比例的影响

2.7 不同浓度MBP 对TM-3 细胞焦亡相关蛋白表达量的影响

各MBP 染毒组cleaved-caspase3 和GSDMEN 蛋白的相对表达量与对照组相比增加。与对照组相比，中、高剂量组cleaved-caspase3、GSDMEN 蛋白的相对表达量均升高（P 均＜0.05），见图7。

图7 不同浓度MBP 对TM-3 细胞焦亡相关蛋白表达量的影响

2.8 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞焦亡相关蛋白表达量的影响

与对照组相比，各染毒组cleaved-caspase3和GSDME-N 的蛋白相对表达均上升。与中剂量组相比，中剂量+抑制剂组的cleaved-caspase3和、GSDME-N 蛋白的相对表达水平均下降，差异有统计学意义（P＜0.01），见图8。

图8 Ac-DEVD-CHO 对TM-3 细胞焦亡相关蛋白表达量的影响

3 讨论

细胞焦亡是一种程序性的细胞死亡方式，它的主要特征是细胞肿胀、细胞膜穿孔和细胞内容物的释放[17]。焦亡通常由炎症小体触发并由气体蛋白执行，它的通路主要分为典型的炎性小体途径，即激活的Caspase-1 进而裂解气体蛋白D（GSDMD）形成GSDMD n 端，GSDMD n 端能够与细胞膜结合形成跨膜孔，诱导细胞焦亡；由脂多糖（LPS）与Caspase-4/5 的直接结合诱导是非典型的炎症小体途径；以及Caspase-3 介导的焦亡途径，Caspase-3 可以裂解气体蛋白E 形成跨膜孔，然后导致细胞进入焦亡过程[9，18]。有研究[19]表明，GSDME 介导的细胞焦亡主要依赖Caspase-3的剪切活化。

Wang 等[9，20-22]研究表明，焦亡细胞在光镜下表现出细胞肿胀和球囊状冒泡的显微镜特征。而本研究显示，MBP 作用于TM-3 细胞后，低、中、高剂量组细胞均出现细胞肿胀和球囊状冒泡的状态，提示细胞可能发生了焦亡。

Hoechst 33342/PI 染色和LDH 释放率测定是鉴定细胞焦亡的常用检测方法[15，23]。LDH 是存在于细胞质的一种糖酵解酶，细胞发生焦亡时，细胞膜上会形成孔洞，LDH 通过孔洞进入细胞外，而PI 染料不能进入细胞膜完整的细胞。所以可以通过检测细胞LDH 的释放和Hoechst 33342/PI 染色情况来判断细胞膜破损情况[24]。本研究结果表明，与对照组相比，MBP 染毒组各组的PI 阳性细胞比例和LDH 释放水平均升高，两者结果提示，MBP 染毒后导致TM-3 的细胞膜发生破损，与何婷婷等[15，24]关于细胞膜破损的研究相似。Caspase-3/GSDME 通路是一种细胞焦亡的通路，GSDME 作为焦亡蛋白，通过其表达量的变化可以判断焦亡的发生与否[9]。本研究结果表明，各剂量组的Caspase-3 和GSDME 的相对表达量较对照组升高，表明MBP 诱导睾丸间质细胞发生了焦亡。Ac-DEVD-CHO 是一种Caspase-3 蛋白抑制剂，Ac-DEVD-CHO 作用于细胞后，与中剂量组相比，中剂量+抑制剂组的细胞存活率提高，LDH 释放率、PI 阳性细胞比例以及Caspase-3 和GSDME 的相对表达水平降低。表明Ac-DEVD-CHO 可以抑制MBP 诱导的睾丸间质细胞焦亡。提示Caspase-3 参与了MBP 诱导的睾丸间质细胞诱导的损伤，并且Caspase-3 是GSDME的上游因子。上述研究结果表明MBP 通过Caspase-3/GSDME 信号通路诱导TM-3 细胞焦亡。

综上所述，MBP 可以通过Caspase-3/GSDME通路诱导睾丸间质细胞焦亡，为进一步阐明PAEs 雄性生殖毒性机制提供了实验依据，但关于PAEs 的雄性生殖毒性的作用机制还有待进一步探索。