次氯酸消毒种蛋效果研究

国纪垒，魏建平

（北票市宏发食品有限公司，辽宁朝阳 211300）

种蛋产出后易受到环境和空气中细菌的污染，不仅影响其自身的孵化，而且污染孵化设备，传播各种疾病。种蛋表面不同程度的带有病菌（如沙门氏菌、大肠杆菌等)，虽然从蛋壳结构上看，种蛋有胶质层，蛋壳和内膜等几道自然屏障，但这些屏障对病菌的阻止能力有限。给种蛋进行消毒，可以消除蛋壳上的病原微生物，减少胚胎死亡，提高受孵率和鸡苗质量。因此对种蛋进行彻底的消毒灭活尤为重要。种蛋消毒要求消毒药无副作用，无刺激性气味，无生命体内残留，不影响受精率和孵化率。

传统种蛋甲醛熏蒸消毒的方法具有毒性和刺激性，会对工作人员和设备造成伤害。欧盟、美国、日本等国外已出台相关法律法规，明确禁止药品生产车间使用甲醛熏蒸.。国内学者也建议使用安全的消毒技术来代替甲醛熏蒸。此外，现场种蛋装箱重叠码放的现状，限制了消毒操作。微酸性次氯酸溶液具有很强的杀菌作用，且具有广谱、强效、快速、安全、对环境无污染等优点。为研究次氯酸对种蛋消毒的效果和对孵化指标的影响，本试验选择经过实验室杀菌试验筛选最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC) 值最高的次氯酸，开展种蛋喷雾消毒试验，以期解决种蛋消毒的难题，从而提高孵化成绩。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

不同浓度的次氯酸由购自沈阳溢源公司的YY-80 次氯酸发生器生产，试验前使用3M 公司生产的余氯检测试纸检测氯浓度。对照消毒剂为企业自购市售的6 种常用消毒剂，分别为：二氧化氯、次氯酸钠、过氧化氢、过氧乙酸、戊二醛、过硫酸氢钾。大肠埃希菌菌种和大肠埃希菌耐药菌均来自北票市宏发食品有限公司检测中心鉴定验证后保存的菌种。微生物培养材料、养琼脂等购自北京路桥技术股份有限公司。

1.2 主要仪器

生物安全柜购自上海沪净医疗器械有限公司；500 型电热恒温培养箱购自龙口先科仪器公司；19200 型单体孵化器购自蚌埠依爱电子科技有限责任。

1.3 种蛋采集

按照北票市宏发食品有限公司种蛋选择标准选取某种鸡场饲养的46 周龄科宝父母代种鸡所产种蛋。试验地点为种鸡场及配套孵化厂；试验时间为2023 年5—8 月。

1.4 试验方法

1.4.1 大肠埃希菌和大肠埃希菌耐药株的消毒药筛选试验

选择市场常见和企业常用的7 种消毒剂，以说明书建议的浓度为基本浓度，设置10、20 和50 倍3 个浓度梯度，分别与108CFU/mL 的大肠埃希菌和大肠埃希菌耐药株，在试管肉汤培养基内作用10min 后，37℃培养24h，观察培养肉汤的变化，肉汤清亮的最低稀释倍数为有效抑菌浓度。

1.4.2 种蛋表面大肠埃希菌消毒试验

取46 周龄的种蛋36 枚，按照参考文献[2,6]所述方法，设置10、20、50mL/L 共3 个次氯酸浓度组，每组9 枚，对照组9 枚，试验在生物安全柜中进行，试验组和对照组按照每枚种蛋0.5mL剂量蛋壳表面喷雾含菌量108CFU/mL 大肠埃希菌液3min 干燥后，在超净台内进行次氯酸消毒喷雾，试验组从低浓度到高浓度，每枚0.5mL，对照组每枚喷生理盐水0.5mL，喷雾消毒结束后，静置5min。参照《食品微生物生物学检验 菌落总数测定》（4789.2—2016)，每组9 枚种蛋按照对角线选择5 枚种蛋表面用2.5cm 制圆形采样规板涂抹取样，合并成1 个样品，每个样品做10-1到10-6稀释，选择10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释倍数，每个稀释倍数接种伊红美兰琼脂平板0.1mL，37℃培养24h 并计数。比较3 个试验组与对照组对大肠埃希菌的灭菌率。

1.4.3 孵化厂种蛋弥雾消毒试验

选择0～40μm 可调弥雾机，调整至5μm、20μm 2 个雾粒直径，射程3m、喷雾量60mL/min，加入染色剂测试喷雾后观察着色均匀度，按照每箱种蛋280 枚，4 箱一摞码放，计算喷雾量约为230mL，设置喷雾时间4min，沿蛋箱周围约20cm 的距离均匀喷雾。根据着色均匀的喷雾距离选择50ml/L 的次氯酸，使用弥雾机对库存种蛋进行20μm、5μm 不同雾粒雾化消毒。选择中间层的种蛋检测表面细菌总数、金黄葡萄球菌和致病性霉菌，消毒前后细菌总数、金黄葡萄球菌数和致病性霉菌数量均符合标准，比较消毒前后灭菌率。

参照《公共场所卫生检验方法第3 部分空气微生物》（GB/T 18204.3—2013) 《活禽疫病与禽肉卫生质量检测程序及内控标准》（北宏牧企字[2021]第001 号) 的检测方法，验证次氯酸对大肠杆菌的消毒浓度和效果。喷雾结束后，取中间2 盘种蛋带回实验室，每盘选择对角线的5 枚种蛋，使用2.5cm 的规板于种蛋表面涂抹取样，合并成1 个样品，每个样品做10-1到10-6稀释，选择10-4、10-5、10-6三个稀释倍数，每个稀释倍数做 3 个平板，接种伊红美蓝培养基（eosin-methylene blue medium，EMB)、高盐甘露醇琼脂平板和孟加拉红琼脂平板，37℃培养24h，统计细菌总数、金黄葡萄球菌、致病性霉菌。

1.4.4 孵化场种蛋消毒孵化效果对比试验

选择北票市宏发食品有限公司孵化中心46周龄科宝鸡群的种蛋，分试验组19200 枚和对照组18570 枚，试验组使用浓度为10mL/L 的次氯酸，每枚种蛋喷雾剂量0.7mL；对照组按照相同喷雾剂量，喷雾300 倍稀释的戊二醛，试验组和对照组同机孵化场。出雏后单独捡雏，统计孵化成绩，比较2 种消毒药消毒种蛋后的孵化效果。

1.4.5 菌落计数

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不计数。若片状菌落不平到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布有很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。

1.5 数据分析

灭菌率、受精率、污染率、中止率的计算见公式（1)～（4)。

式（4) 中，早死胚数量为1～5 胚龄死胚数；中死胚数量为6～14 胚龄死胚数。

2 结果与分析

2.1 大肠埃希菌的消毒药筛选试验

选择市场常见和企业常用的7 种消毒剂，对标准大肠埃希菌和耐药大肠埃希菌做灭菌效果试验。由表1 可知，与其他6 种常用消毒剂相比，次氯酸在相同时间内具有最低的灭菌浓度。

表1 不同消毒剂对大肠埃希菌灭菌效果

2.2 次氯酸消毒种蛋的试验结果

2.2.1 种蛋表面大肠埃希菌喷雾消毒试验结果

由表2 可知，种蛋表面喷雾108CFU/mL 大肠埃希菌后，喷雾10～50mL/L 次氯酸作用10min，大肠埃希菌数量降低，其中50mL/L 降低3.5×104CFU/mL，20mL/L 降低1.78×105CFU/mL，10mL/L 降低1.75×105CFU/mL。比较生理盐水对照组，灭菌率达到99.35%～97.61%。

表2 不同浓度次氯酸对种蛋表面大肠艾希菌的灭菌效果

2.2.2 装箱重叠码放种蛋弥雾消毒试验结果

由表3 可知，与消毒前相比，大雾滴组和小雾滴组均能降低细菌总数、灭菌率，其中小雾滴组效果较好。

表3 次氯酸对种蛋表面的消毒效果

根据以上试验结果，制定次氯酸雾化消毒种蛋操作程序：次氯酸浓度50mL/L，弥雾机雾化粒子直径20μm，按照每枚种蛋0.2mL 的剂量，喷雾时间4min。种蛋送到孵化场后随机抽样，检测种蛋表面微生物，设定内控标准为：细菌总数合格标准≤50CFU/cm2，金黄葡萄球菌数合格标准≤10CFU/cm2，检测结果见表4。6 月份共计抽查种蛋9 个样品全部合格。种蛋孵化出雏后，检测雏鸡和毛蛋的大肠埃希菌和沙门氏菌均为阴性，无气囊浑浊的现象。

表4 孵化场种蛋表面消毒效果检测

2.3 次氯酸分子水喷雾消毒种蛋的孵化成绩对比试验结果

由表5 可知，使用浓度为50mL/L 的次氯酸喷雾的种蛋，与使用戊二醛喷雾消毒种蛋同机孵化，次氯酸喷雾组受精率高于戊二醛喷雾组，中止率低于戊二醛喷雾组，污染率没有上升。

表5 种蛋次氯酸和戊二醛喷雾消毒效果

3 讨论

研究结果表明，pH5.0～5.8 的次氯酸带中性电荷，与人和动物有机体自身免疫功能中嗜中性白细胞生成的次氯酸溶液酸度一致，并被机体组织细胞所接受，次氯酸很容易穿透带负电荷的细菌细胞壁，通过氧化细胞壁杀死细菌或者通过细胞壁进入，分解破坏微生物的氨基酸和酶系统，进而控制微生物的蛋白质合成，终止微生物的代谢功能[1]。本试验结果表明，次氯酸对大肠埃希菌和大肠埃希菌耐药菌株有较强的杀灭作用。种蛋消毒试验和孵化指标跟踪结果显示，次氯酸对种蛋消毒效果良好且不影响孵化指标。次氯酸以无毒无害无刺激性的优势，加之弥雾机的配合，实现了种蛋全天候消毒，解决了现场装箱重叠码放种蛋消毒和种蛋随检随消的难题，同时为孵化厂醛类消毒剂的替代提供了数据支撑。

4 结论

本试验通过对比次氯酸与其他市售的6 种消毒剂对大肠埃希菌及大肠埃希菌耐药菌株的杀灭实验，验证了次氯酸在相同时间内具有最低的灭菌浓度。根据次氯酸消毒种蛋的试验结果，制定次氯酸雾化消毒种蛋操作程序：次氯酸浓度50mL/L，弥雾机雾化粒子直径20μm，按照每枚种蛋0.2mL 的剂量，喷雾时间4min。设定内控标准为：细菌总数合格标准≤50 CFU/cm2，金黄葡萄球菌数合格标准≤10CFU/cm2。

种蛋经孵化出雏后，孵化指标优于戊二醛消毒组，检测雏鸡和毛蛋的大肠埃希菌和沙门氏菌均为阴性，无气囊浑浊的现象。可见，次氯酸完全可以替代戊二醛进行孵化厂的种蛋消毒。