牛冷冻精液精子形态活力变化研究与分析

段 凯，李红婵，汪聪勇，徐美芳*

（1.河南省鼎元种牛育种有限公司，河南郑州 450046；2.河南省兽药饲料监察所，河南郑州 450008）

人工授精技术在畜牧业发展中有着至关重要的作用，特别是在牛的繁殖育种中更为重要，牛的精液能够长期冷冻保存，并在牛的繁育生产中得到大规模的应用与推广。自20 世纪60 年代开始，牛的普通冷冻精液在肉牛和奶牛的人工授精中得到了广泛应用，而且世界各国很快也相继采用液氮作为保存牛常规冷冻精液的冷源。借助于精液冷冻保存技术，能有效地延长精液的可利用时间并通过精液运输实现异地输精，从而大幅度提高种公牛的利用效率，减少种公牛养殖量。然而，在牛的繁殖生产的实践中发现，牛常规冷冻精液解冻后在室温中保存，输精时间越晚，与配母牛的受胎效果越差，这与解冻后精液品质的变化有关。顶体完整率、精子畸形率及精子活力是评价精液品质的主要指标。顶体异常包括顶体形态异常和顶体脱落。顶体正常的牛精子主要特征是有明显的顶脊，顶体部分呈均匀一致的紫红色，核环部分呈规则的月牙形，顶体轻微膨胀。顶体部分脱落和完全脱落意为顶体脱离精子，露出被顶体覆盖的细胞核。顶体异常会导致顶体酶受到破坏，严重影响受精效果。

本研究通过探讨牛常规冷冻精液解冻后的顶体完整率、精子畸形率和精子活力的变化，揭示解冻后不同时间内精液品质的变化规律，为牛冷冻精液解冻后质量水平的评定和人工授精的最佳时间提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选取河南某种公牛站41118268 号种公牛生产的同一批次300 剂常规冷冻精液，进行精液品质测定。

1.2 试验仪器、设备、药品及试剂

恒温电热水浴锅（上海力辰仪器科技有限公司)、相差显微镜（奥林巴斯北京销售服务有限公司)、血球计数器、载玻片、盖玻片、密度仪（米尼图生物技术（北京) 有限公司)、5.0mL 试管、吉姆萨染液（西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)、香柏油、3.0%氯化钠溶液。

1.3 测定方法

对每剂冷冻精液进行解冻稀释，在刚解冻0h和解冻1、3、6、9h，均制作1 压片标本、1 抹片标本，观察并记录精子的活力、密度、畸形率、顶体完整率以及前进运动精子数。

1.3.1 牛冷冻精液的解冻

解冻时迅速用镊子夹住细管，直接投入37℃温水中晃动10s，取出后再用手搓动7～8s 并擦干，剪去封口端，把精液注入到准备好的干净、干燥、无菌的5.0mL 试管中，用温度计测定解冻后的温度。

1.3.2 精子活力检查

取解冻好的细管冻精剪去封口端推入小玻璃管中混匀，取10μL 滴在37℃恒温板上的载玻片上，盖上盖玻片后于37℃恒温台的显微镜下放大400 倍观测活力和密度。精子的活力即前进运动精子数占总精子数的百分率。

1.3.3 精子畸形率检查

刚解冻后在载玻片上滴1 滴精液制成抹片，干燥后用固定液固定30min，然后用吉姆萨染液染色1.5h 后镜检计算畸形率。

1.3.4 精子顶体完整率检查

用测过畸形率的抹片，上面滴1 滴香柏油，用油镜头进行观察，计算出顶体完整率和异常率。

1.3.5 前进运动精子数检查

精液解冻后用血色素管准确吸取10μL，注入盛有0.99mL 3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为100 倍稀释的稀释精液，将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用移液器吸取8μ L 稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满。静置约5min 后在显微镜下计数。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2010 及SAS 9.4 进行整理、分析，试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 解冻后不同时间内的顶体完整率、精子畸形率和精子活力

由表1 可知，与刚解冻时相比，解冻后1h精子顶体完整率下降，但差异不显著（P＞0.05)，解冻后3h、6h、9h 的精子顶体完整率显著低于刚解冻时和解冻后1h（P＜0.05)。精子畸形率在精液解冻后随着时间延长而逐渐升高，刚解冻时与解冻后1h 差异不显著（P＞0.05)，但显著低于解冻后3h、6h（P＜0.05)，且解冻后3h 的精子畸形率也显著低于解冻后6h 的畸形率（P＜0.05)。精子活力在精液解冻后随着时间延长而逐渐降低，刚解冻时的精子活力最高，与解冻后1h、3h、6h、9h 差异显著（P＜0.05)，解冻后1h精子活力显著高于6h（P＜0.05)，解冻后9h 时精子活力低于任何一个阶段的活力，且差异显著（P＜0.05)。

表1 种公牛精液不同解冻时间品质分析

2.2 解冻后的前进运动精子数

解冻后300 次测定结果显示每剂精液的前进运动精子数都在0.9×107～1.2×107个/剂，平均每剂细管冻精前进运动精子数为1.0×107个。

3 讨论

3.1 各精液品质变化规律

精子畸形包括头部畸形和尾部畸形，头部畸形的主要是头大，头小，长形头，梨形头，头部突起等，尾部畸形的有中段线粒体膨胀、尽心端弯折、线粒体脱落、有原生质滴等，还有尾部弯曲、断尾、无尾等。还有的精子发育不健全，尾和头连在一起，尾未能完全伸开。本研究精液中精子畸形率在刚解冻时平均值已达到31%，而用于输精的精液要求畸形率不得高于20%。这可能与精液自身品质有关，也可能是在进行冷冻保存时，精子已受到损伤。

有效精子数即呈直线前进运动的精子数，计算方法为精子总数乘以精子活率。牛每剂量冷冻精液前进运动精子数是评价冻精产品质量的一项关键性指标，该项指标不仅与受胎率有关系，还关系到优秀种公牛冷冻精液的产量及种公牛遗传资源的利用率。根据《牛冷冻精液》（GB4143—2022) 规定前向运动精子数大于等于600 万个/剂。目前国内对降低单剂量前进运动精子数也进行了初步的研究。李连起等[11]研究表明，当每剂量前进运动精子数降低到500 万时，不影响其人工授精后的情期受胎率，可以广泛推广应用。虽然李慧颖等[12]认为牛细管冻精前进运动精子数不应低于800 万，但张壮志等[13]研究表明当每剂量前进运动精子数降低到600 万时，不影响其人工授精后的情期受胎率。王彦平[14,15]研究结果表明当每剂量中前进运动精子数降低到200 万时，不影响青年牛人工授精后的情期受胎率。本试验测得的前进运动精子总数平均值为1.0×107个/剂，达到了国标的要求但是相比而言，我国种公牛平均年单产较发达国家种公牛冷冻精液生产水平差距甚远，难以满足遗传改良的整体需要，种公牛的遗传潜力尚未得到充分的发掘与利用。为了在今后的牛改良工作中更大限度地利用优良种畜的遗传资源，促进畜群良种化，使优良种公牛的冷冻精液发挥更大的作用，在不影响受胎率的情况下，可以尝试降低冻精每剂量的前进运动精子数，以提高优秀种公牛的冻精产量，并保证理想的配种受胎率。

4 结论

刚解冻时顶体完整率、精子畸形率与解冻后1h 差异大，刚解冻时的精子活力最高。人工授精时，刚解冻精液与解冻1 小时内精液的顶体完整率较好、精子畸形率较低，此时输精效果为佳。