实时荧光定量PCR在血站核酸检测中的应用效果

帅敏 乐山市中心血站 （四川 乐山 614000）

内容提要： 目的：观察并分析在血站核酸检测中实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）的应用效果。方法：选取2023年1月～2023年6月17564分无偿献血者样本，都是经过乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体初检和复检都合格的样本，对其进行实时荧光定量PCR的核酸检测。结果：在17564无偿献血者的血液样本中，经过实时荧光定量PCR技术检测，共有25例乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸阳性，0例丙型肝炎病毒核糖核酸和人类免疫缺陷病毒（1型）核糖核酸阳性。在临检中心举行的室间质评中，所有检验结论均正确，得分为100分。结论：在血站核酸检测中采用实时荧光定量PCR技术，可有效减短病毒检测窗口期，有助于血液安全水平的提高。

实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术具有高度的灵敏度和特异性，其能够检测到非常低浓度的目标脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），甚至在样本中只有几个分子的情况下也能够进行准确的检测[1,2]。实时荧光定量PCR技术的高灵敏度能够及早发现这些病原体，从而采取相应的措施，确保献血的安全性。实时荧光定量PCR能够大大缩短检测时间，通过使用这种方法，血站能够有效降低输血危险的“窗口期”，确保输血的高度安全[3,4]。基于此，本研究取2023年1月～2023年6月17564例无偿献血者，对其血液样本进行乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）RNA和人类免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Virus，HIV-1）RNA检测，以实现无偿献血人群的核酸筛查目标。现将细致报告如下。

1.材料与方法

1.1 一般材料

选取2023年1月～2023年6月17564份经过HBV表面抗原（Hepatitis B Surface Antigen，HBsAg）、HCV抗体、HIV抗体初检和复检2次检测结果均为阴性的无偿献血者样本，全部样本经过实时荧光定量PCR技术检测。

试剂：①初检试剂：乙型肝炎病毒检测试剂盒（HBsAg）英科新创（厦门），丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒（ELISA）北京万泰，人类免疫缺陷病毒酶免诊断试剂盒（HIV）北京万泰。②复检试剂：乙型肝炎病毒检测试剂盒（HBsAg）DiaSorin（索灵），丙型肝炎病毒酶免检测试剂盒（HCV）奥斯邦Ortho-Clinical Diagnostics，人类免疫缺陷病毒酶免诊断试剂盒（HIV）伯乐Bio-Rad。③核酸检测试剂：乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒（1型）核酸检测试剂盒（PCR荧光法），广州达安基因股份有限公司。

仪器设备：①酶免检测设备：STAR 全自动样本处理系统（HAMILTON）；FAME24/20 全自动酶免检测系统（HAMILTON）；爱康全自动血型检测系统，AU400贝克曼全自动生化分析仪。②核酸检测设备：DA3500S型全自动核酸提取仪；AFD4800实时荧光定量PCR仪；JW-1042R低速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；开盖机（珠海倍健电气技术有限公司）；HR40-‖A2型生物安全柜（青岛海尔特种电器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品检测

对所有样本进行HBsAg、HCV抗体、HIV抗体检测，经过初检和复检两次检测结果均为阴性的样本，进行实时荧光定量PCR检测。

DA3500S全自动核酸提取仪采用八混样进行核酸检测。每个样本取200µL的血浆，总共1600µL。当样品数量不足8个时，检测系统会自动计算每个样本汇集量，使汇集总量达到1600µL。样本汇集完成后，采用磁珠法进行核酸提取。提取完成后，用AFD4800实时荧光定量PCR仪扩增仪完成模板的扩增。如果扩增结果为阴性，那么该孔汇集的8个样本都被判定为无反应性。如果扩增结果为阳性，那么该孔汇集的8个样本都进行拆分实验，进行单孔测试，单孔测试为阴性则判定为无反应性；如果单孔检测为某项目阳性则判定为该项目反应性。

1.2.2 结果判读

核酸样本判读规则见表1。

表1.核酸样本判读规则

1.2.3 质量控制

对每一次检测都做两孔室内质控，一孔放在加样的第一孔位置，用专用稀释液稀释后检测，用于实验有效性的判定；第二孔放在混检样本的最后一孔，用已检测结果为阴性的样本的血浆稀释后检测，用于试剂性能的监控，再加上一个阳性对照和一个阴性对照，以及每个孔内均设的内对照，其对照结果见表2判读结果。每年均参加临检中心举办的室间质评活动和省血液安全管理中心组织的室间质评活动。

表2.阳性、阴性及内对照结果判读原则

1.3 观察指标

观察全部血液样本检测结果和室间质评检测结果状况。

1.4 统计学分析

2.结果

2.1 一般结果描述

在17564例无偿献血者的血液样本中，经过实时荧光定量PCR技术检测，共有25例HBV-DNA阳性，0例HCV-RNA和HIV-RNA阳性。

2.2 国家举办室内质量控制评估检测结果状况

在国家卫生计生委临检查中心举行的室内质量控制评估中，所有检验结论均正确，共计得分100分。

3.讨论

实时荧光定量PCR是一种外体模拟自动进行DNA复制过程的技术[5]。通过变性、退火和延伸三步反应的循环，DNA模板被扩增到了2的n次方倍。在此过程中向系统中添加荧光团，实现对荧光信号的积累，从而可以实时监控PCR全过程。在PCR扩增的指数期间可通过Ct值来定量分析模板数量，并以此模板为基准测量待检测样本的复制数量，二者呈线性相关[6]。适用于定量分析的模板进行后续操作。

实时荧光定量PCR是一种高效、准确的核酸检测技术，在血站核酸检测中具有诸多优势[7,8]。首先，实时荧光定量PCR具有高灵敏度。能够检测到非常低浓度的核酸，甚至是单个分子水平的检测，在早期感染的诊断中非常有用，特别是对于那些病毒或细菌感染，其病原体含量较低的情况下。其次，实时荧光定量PCR具有高特异性。在区分不同病原体的检测中非常有效，可以准确鉴定出感染的病原体类型。此外，实时荧光定量PCR具有快速高效的优势。相较于传统的PCR技术，实时荧光定量PCR不需要进行后续的凝胶电泳分析，而是通过实时监测荧光信号的变化来定量检测目标序列。这种实时监测的特点使得实时荧光定量PCR能够在短时间内可靠、准确的完成检测。另外，实时荧光定量PCR具有宽线性范围，通过合理设计引物和探针，可以在不同浓度范围内都能够准确定量，在血站核酸检测中非常适用，可以满足不同样本的检测需求。总之，实时荧光定量PCR的应用可以提高核酸检测的准确性和效率，为血站的病原体筛查和感染性疾病的诊断提供重要的技术支持[9,10]。

HBsAg、HCV和HIV的传统筛查技术存在“窗口期”较长的问题[11]。相比之下，核酸检验可以使三者的检测“窗口期”由56d、82d、22d，缩成33d、22d和11d[12,13]。此外，该方法还可用于检测免疫技术无法检测到的抗体、隐性感染、隐性乙型肝炎病毒和病毒变体，从而更好地确保血液的安全[14]。经本研究内容得，在17564例无偿献血者的血液样本中，经过实时荧光定量PCR技术检测，共有25例HBV-DNA阳性，0例HCV-RNA和HIV-1-RNA阳性。由此可见，在血站检测中，实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度和良好的重复性，使其成为更好、更直接和更容易使用的选择。使用该方法可以更好的整合实验步骤，提高实验室的自动化水平，进一步简化操作并提高效率，更高效地提取核酸，设计灵敏且特异的核酸测试方法[15]。在具体检测操作时，有以下几点内容需要注意[16]：①确保样本的质量，使用无脂血、溶血和黄疸的合格样本。②确保试剂的存放条件符合要求，常温保存的提取试剂要保存在18°C～30°C，扩增试剂要保存在-20°C～40°C，质控品最好保存在-80°C，这样可以认为在较长一段时间内的质控品的品质都是一致的。③定期校验核酸提取设备和PCR扩增设备，及时发现设备性能的变化。④切实做好防污染措施，确保进入扩增的八联管都盖紧了，并及时将扩增产物传递到废物处理间，防止扩增产物的污染。⑤作好实验室被扩增产物污染的应急预案，除了及时消除被污染的扩增产物外，同时启用其他未被污染的区域和设备完成后续检测；如果污染严重，本站无法完成何时检测，则应应急启动互为备份核酸检测实验室的友邻血站核酸实验室完成后续检测。

在核酸扩增检测过程中，AFD4800实时荧光PCR仪，能够快速、准确地把目标病毒模板以2的n次方倍数进行扩增，经过45个循环后可以达到2的45次方的天文数字，理论上只要有一个目标病毒的模板存在都能被检测出来。台式冷冻离心机是必不可少的工具，它能在离心机高速旋转时降低因空气摩擦导致的样本温度升高，防止待测病毒被降解。生物安全柜则提供了一个安全的工作环境，确保操作人员安全，提高实验的效率和准确性[17]。STAR全自动化样本处理系统和FAME24/20全自动酶免检测系统进一步提高了酶免实验的自动化程度，减少了操作人员的工作量，提高了实验结果的一致性。总之，以上列举的设备在血站核酸检测中发挥着各自的作用，共同构建了一个高效、准确的实验流程，为血站的工作提供了重要的支持。血站通过这些设备的使用，能够更有效的发现处于窗口期的献血者，确保临床用血的安全供应。

综上所述，在血站核酸检测中采用实时荧光定量PCR技术，可以有效缩短病毒检测窗口期，能提升对窗口期无偿献血者的筛查能力，有助于血液安全水平的提高。