电针不同特定穴对慢性结肠炎大鼠的效应差异性研究

唐坤鹏,吕嘉琪,文 坛,张春青,马梦娜,高 婷,闫丽萍

(山西中医药大学,山西 晋中 030619)

炎症性肠病(IBD)是肠道慢性非特异性炎症性疾病,过去数十年来西欧及北美等发达国家的发病率高于中国等发展中国家,但近年来在我国的发病率升高,且青少年多见[1]。目前研究认为肠道炎症、免疫反应失调和上皮屏障受损等因素与IBD的发病密切相关[2-3],但具体病因不明,无特异性治疗方法,西医主要采用5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂或生物制剂等治疗[4],短期疗效确切,但长期应用有明显不良反应,且复发率较高[5]。诸多临床研究证实,针灸具有减少疾病活动、减轻肠炎反应、改善肠道免疫屏障功能、修复肠黏膜损伤等作用,并且在降低复发率、减少不良反应、维持长期疗效等方面具有独特优势[6-7]。临床腧穴的选取多以与大肠腑联系密切的特定穴为主,但由于不同腧穴间存在相对效应特异性,因此针对同一疾病不同特定穴位间的疗效也存在差异[8-9]。基于此,本研究制备大鼠慢性结肠炎模型,观察电针4个不同特定穴的疗效差异,以为研究经穴效应特异性提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 60只SPF级SD大鼠,雌雄各半,体重(200±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。大鼠分笼适应性喂养于山西中医药大学科研实验中心SPF级动物房,温度22～26 ℃,相对湿度50%～60%,自由摄食饮水,1周后用于实验。本实验方案经山西中医药大学伦理委员会批准(2018DW181),严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》进行实验操作。

1.2主要试剂与仪器 完全弗氏佐剂(CFA,F5881,Sigma),PMSF蛋白酶抑制剂、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5×(武汉Bosterbio,批号分别为AR1179和AR1112),基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抗体(索莱宝生物科技有限公司,货号:K109533P),基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体(武汉Bosterbio,货号:BM4075),羊抗兔IgG-HRP(武汉Bosterbio,货号:BA1056),β-actin鼠抗(北京博奥生物技术有限公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海Beyotime,批号:P0012S),彩色PAGE快速凝胶试剂盒(上海absin公司,货号:abs9367)。高速冷冻离心机(曦玛离心机有限公司),Tanon5200成像仪(美国Bio Tek公司),DYY-6C型电泳仪(北京六一)。

1.3分组、造模及干预 将60只大鼠随机分为6组,每组10只。模型组和天枢组、大肠俞组、足三里组、上巨虚组大鼠均采用免疫复合致敏法[10]制备慢性结肠炎模型:采用抗原上清液(家兔结肠黏膜中加入适量生理盐水匀浆制成)与CFA同等比例混合制备抗原乳化液,然后分别在大鼠足跖(第3天)、足趾(第10天)、背部皮下(第17天)、腹股沟(第24天)、腹腔内(第31天)注射抗原乳化液8 mg,至大鼠血清抗兔结肠抗体达到一定效价时,大鼠禁食不禁水24 h后采用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)行腹腔麻醉,给予2%福尔马林液灌肠并留置60 min,用生理盐水冲洗后,采用不加CFA的抗原液再次灌肠并留置2 h,随后用生理盐水冲洗,完成造模。参考李盼盼等[11]实验方法验证造模是否成功。正常组用生理盐水替代造模试剂并按上述方法平行操作。于造模成功后,参照《实验针灸学》[12]及大鼠标准穴位图谱[13]对穴位定位,天枢组、大肠俞组、足三里组、上巨虚组分别采用华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪电针双侧天枢(ST25)、大肠俞(BL25)、足三里(ST36)、上巨虚(ST37)腧穴,均使用规格为0.18 mm×25 mm毫针(北京中研太和)直刺5 mm,同侧穴位连接同对电极,频率为2 Hz/50 Hz,强度2 mA,以大鼠肌肉或针柄微颤为宜,20 min/次,1次/d,连续干预10 d。正常组、模型组只在相同时间以相同方式进行固定。

1.4检测指标及方法

1.4.1大鼠一般状态及疾病活动指数(DAI) 观察各组大鼠的精神状态、体重、毛发光泽度、饮食、粪便性状、腹泻程度及血便状况,按照以下标准评分:大便性状正常,无便血,体重无下降为0分;体重下降1%～5%,大便松散、半成型,便血阳性为1分;体重下降6%～10%,大便松散、不成型,便血强阳性为2分;体重下降11%～15%,稀水样便,肉眼血便为3分;体重下降≥16%,稀水样便更清长,肉眼血便更显著为4分。

1.4.2大鼠结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分 参考文献[14],依据肉眼及镜下结肠黏膜情况进行评分。0分:结肠组织无损伤;1分:结肠黏膜轻度充血水肿,无溃疡;2分:结肠黏膜充血,肠壁增厚,但无溃疡;3分:肠壁增厚,结肠黏膜出现溃疡;4分:结肠黏膜出现2个或多个溃疡;5分:结肠黏膜出现2个或多个溃疡,溃疡直径>1 cm;6～10分:结肠黏膜出现多个溃疡,如果溃疡直径超过2 cm,则在此基础上每增加1 cm,评分增加1分。

1.4.3大鼠结肠组织病理形态 干预结束后,采用2%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔麻醉大鼠后取结肠组织,冲洗干净后加入4%甲醛组织固定液固定,制备石蜡切片,常规HE染色,漂洗、脱水后经中性树脂封片,40倍光镜下观察。

1.4.4大鼠血清IL-10和TNF-α水平 取大鼠腹主动脉血,离心后严格按照白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(武汉BOSTER,批号分别为EK0417和EK0527)说明书的步骤,采用美国BioTek酶标仪(型号:ELX808)进行检测。

1.4.5大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取液氮速冻的结肠组织,提取蛋白,BCA法测其蛋白浓度。通过配胶、电泳、转膜、脱脂牛奶封闭,分别加入MMP-1、MMP-2及β-actin一抗(稀释度1∶1 000,1∶500,1∶1 000)于4 ℃孵育过夜。次日在二抗溶液(1∶5 000)中室温孵育2 h,洗膜后在条带上滴入ECL发光液(北京索莱宝科技有限公司,MA0186-1)显色曝光,运用Image J软件计算相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠DAI评分和CMDI评分比较 造模后,各造模组大鼠DAI评分均明显高于正常组(P均<0.05),各造模组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。干预10 d后,模型组大鼠DAI评分、CMDI评分均明显高于正常组(P均<0.05);各腧穴组大鼠DAI评分、CMDI评分均明显低于模型组(P均<0.05),且上巨虚组大鼠DAI评分、CMDI评分均明显低于天枢组、大肠俞组及足三里组(P均<0.05),其余组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和慢性结肠炎各组大鼠DAI评分和CMDI评分比较分)

2.2各组大鼠结肠组织HE染色病理形态 正常组大鼠结肠黏膜上皮结构完整,无炎症、坏死;模型组大鼠结肠黏膜明显水肿、糜烂,黏膜下层、肌层有大量炎性细胞浸润,黏膜各层界限不清,肠腺坏死、萎缩;各腧穴组肌层完整,杯状细胞数量较模型组多,炎性细胞浸润减少,其中上巨虚组较其余腧穴组改善明显。见图1。

图1 正常组和慢性结肠炎各组大鼠结肠组织病理形态(HE染色,×100)

2.3各组大鼠血清IL-10和TNF-α水平比较与正常组比较,模型组大鼠血清IL-10水平明显降低(P<0.05),血清TNF-α水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,各腧穴组大鼠血清IL-10水平均明显升高(P均<0.05),血清TNF-α水平均明显降低(P均<0.05);且上巨虚组大鼠血清IL-

10水平明显高于天枢组、大肠俞组及足三里组(P均<0.05),血清TNF-α水平明显低于天枢组、大肠俞组及足三里组(P均<0.05);其余组间血清IL-10、TNF-α水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和慢性结肠炎各组大鼠血清IL-10和TNF-α水平比较

2.4各组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白表达情况比较 模型组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);各腧穴组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且上巨虚组MMP-1、MMP-2蛋白相对表达量均明显低于天枢组、大肠俞组及足三里组(P均<0.05),其余组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2及表3。

图2 正常组和慢性结肠炎各组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白表达情况

表3 正常组和慢性结肠炎各组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

中医学中无IBD的病名,多将其归于“泄泻”“久痢”“肠澼”“便血”等病范畴[15],其病变部位在大肠,但脾胃运化功能受阻是其发生的主要因素。

《景岳全书》中记载“泄泻之本,无不由于脾胃”,因而治疗肠腑病的特定穴又多分布于足阳明胃经。本次实验选取腧穴中,天枢为大肠之募穴,位居腹部,具有通调肠腑、理气活血、止泻消导之效;上巨虚为大肠之下合穴,位于下肢,《灵枢经》言“合治内腑,治内腑奈何?取之于合,大肠属上廉。此以邪在大肠,故当刺巨虚上廉”;足三里虽为胃之下合穴,但其主治病症广泛,且IBD与脾胃关系密切,因此也是治疗大肠腑病的常用特定穴之一;大肠俞乃大肠背腧穴,属于足太阳膀胱经,位于背部,是大肠之经气输注之处,同时也是大肠病证反应点,主治病变位于大肠的相关疾患。本实验采用免疫复合致敏法构建慢性结肠炎模型,造模后大鼠一般状况较差,DAI评分、CMDI评分均显著升高,结肠黏膜损伤严重,提示模型制备成功;各腧穴组给予电针干预后,大鼠一般情况均得到改善,DAI评分、CMDI评分显著降低,结肠黏膜组织均有不同程度的修复,其中上巨虚组改善最为显著,说明电针不同特定穴均可减轻慢性结肠炎结肠黏膜损伤,且电针上巨虚的效果更明显。

慢性结肠炎的发病机制复杂,其中促炎因子与抗炎因子失衡所致的免疫异常是关键机制之一,同时也是评价肠道炎症轻重程度的敏感标记物[16]。其中抗炎因子IL-10及促炎因子TNF-α在慢性结肠炎组织中扮演着重要角色。IL-10可抑制抗原递呈及促炎细胞因子的释放,起到阻止结肠炎症发展的作用[17]。TNF-α由巨噬细胞、单核细胞和分化的T细胞所产生,可增加IL-1β和IL-6等促炎细胞的分泌、表达,导致肠道上皮细胞凋亡,是参与介导肠道炎症反应的关键[18-19]。相关研究表明,电针可通过下调结肠炎模型小鼠血清TNF-α含量和上调IL-10含量以维持细胞因子平衡,缓解肠道炎症[20-22]。本实验结果显示,电针干预后各腧穴组大鼠血清IL-10水平显著升高,血清TNF-α水平显著降低,其中上巨虚组各指标改善较其他组明显,表明电针上巨虚、天枢、大肠俞及足三里均可有效抑制肠道慢性炎症,且电针上巨虚抑制炎症作用更为显著。

基质金属蛋白酶是一种可以靶向裂解细胞外基质(ECM)的蛋白分解酶,由前肽、锌金属蛋白酶结构域、铰链区和C末端血红素结构域所组成[23]。MMP-1、MMP-2作为基质金属蛋白酶家族成员分别属于间质胶原酶与Ⅳ型胶原酶。已有研究证实,MMP-1、MMP-2对肠道上皮屏障功能有直接影响,并参与受损上皮组织的修复,对细胞间紧密性造成破坏,从而加重结肠黏膜的损伤,是炎症性肠病溃疡发展的关键因素[24-26]。因此,MMP-1、MMP-2在结肠组织中的表达可作为衡量结肠炎严重程度的重要指标[27]。本研究中各腧穴组大鼠结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白表达量均低于模型组,且上巨虚组较天枢组、足三里组、大肠俞组降低更为显著。结合结肠组织病理改变,进一步表明电针上巨虚对于肠道慢性炎症损伤的修复具有相对特异性。

综上所述,电针天枢、大肠俞、足三里、上巨虚可能是通过调节促炎因子与抗炎因子平衡,抑制结肠组织中MMP-1、MMP-2蛋白的表达,从而改善慢性结肠炎肠道炎症损伤,其中电针上巨虚的作用更明显,提示上巨虚对慢性结肠炎的治疗可能存在相对特异性,但对于产生这种效应差异性的确切作用机制需要进一步深入研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。