白背飞虱Tramtrack蛋白结构特点及在受精卵和5龄若虫头部的高表达

冯博 杨梅 伍俭儿 王方海

摘要  ［目的］了解重要的转录因子Tramtrack蛋白的结构特点，以及在卵和5龄若虫身体各部位的表达情况。［方法］在已获得的白背飞虱tramtrack基因的cDNA序列基礎上，对其编码的Tramtrack蛋白结构特点进行生物信息学分析。［结果］该蛋白等电点为8.24，属于碱性蛋白，无信号肽，属于亲水性蛋白，有多个磷酸化位点，其三维结构主要是α-螺旋，少部分是β-折叠。定量PCR检测表明在白背飞虱受精卵中tramtrack基因的表达明显高于未受精卵；此外tramtrack基因在五龄若虫头部表达显著高于在胸部或腹部表达。［结论］这是第一次有关水稻害虫稻飞虱的Tramtrack蛋白的研究报道，为今后探究该蛋白在水稻害虫中的具体功能角色提供前期基础。

关键词  Tramtrack；结构分析；白背飞虱；基因表达

中图分类号  Q966  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）04-0133-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.029

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Structural Characteristics of Tramtrack Protein and Its High Expression in the Head of Zygotes and Fifth Instar Nymphs of Sogatella furcifera

FENG Bo， YANG Mei， WU Jian.er et al

（State Key Laboratory for Biocontrol and Resource Utilization/Institute of Entomology， Sun Yat.sen University， Guangzhou， Guangdong 510275）

Abstract  ［Objective］To understand the structural characteristics of Tramtrack protein， and its expression in eggs and the 5th instar nymph.［Method］The structure of Tramtrack protein of Sogatella furcifera encoded by the obtained cDNA sequence of tramtrack gene was analyzed. ［Ｒesult］The protein was a basic protein， no signal peptide， a hydrophilic protein with multiple phosphorylation sites and its isoelectric point was 8.24. The three.dimensional structure of the protein was mainly α.helix， and a small part was β.fold.  Quantitative PCR detected that the mRNA level of tramtrack gene in the fertilized eggs of white.backed planthopper was much higher compare to that in unfertilized eggs.  In addition， the mRNA level of tramtrack gene in the head of fifth instar nymphs was much higher compare to that in the chest or abdomen.  ［Conclusion］This is the first detailed report on the Tramtrack protein of white.backed planthopper， which lays a foundation for further in vitro expression and functional study of this protein gene， and is conducive to the future exploration of the specific function and regulatory role of this protein in the growth and development of rice planthopper.

Key words  Tramtrack；Structural analysis；Sogatella furcifera；Gene expression

基金项目  广东省自然科学基金项目（2021A1515012402）。

作者简介  冯博（1997—），男，天津人，硕士研究生，研究方向：昆虫学。*通信作者，教授，博士，从事昆虫学研究。

收稿日期  2023-02-18

Tramtrack蛋白是由tramtrack基因编码的蛋白质，隶属于BTB（Broad-complex，Tramtrack，and Bric.a.brac）蛋白家族，最早发现于果蝇［1］。对tramtrack基因的研究表明，该基因具有特定的锌指结构，在其N末端则带有BTB结构域，也称为poxvirus and zinc finger（POZ）结构域。组成该结构域的120个氨基酸以疏水性氨基酸为主，形成由4段α螺旋和部分β折叠所组成的二级结构，进一步形成具有特定的可与其他蛋白发生相互作用的三维空间结构［2-3］。该结构域既可以参与同源二聚体的形成和蛋白质间的交互作用，也能改变染色质的结构，导致特定基因的开关［4-5］。BTB 蛋白遍布在整个真核生物中，且不同物种间的BTB蛋白高度保守［2］。研究发现BTB 蛋白具有多种功能，如调节转录、重构染色质、降解蛋白等。在哺乳动物中也有报道BTB 蛋白影响淋巴细胞发育、轴突导向和性腺形态发生等［5］。而锌指蛋白可与特定的DNA 序列结合，从而影响或调控某些基因的表达［6］。

tramtrack基因已发现多种，表达的蛋白功能多样，在生物体生长发育等过程中起到重要的调节作用。研究发现在果蝇中该基因参与神经系统的分化［7-8］、调节卵泡成熟及排卵［9］、参与雄性求偶行为调节［10-11］等。随着测序技术的进步和发展，许多昆虫基因组序列得到解码和公布，愈来愈多的昆虫tramtrack基因被发现［12-13］，但除果蝇外，其他昆虫中有关Tramtrack蛋白的结构和功能则研究很少，特别在水稻害虫中，该类蛋白的结构和功能都是未知，有待研究。

白背飞虱（Sogatella furcifera）为水稻重要害虫，属昆虫纲半翅目飞虱科［14］。成虫前胸背板以及中胸背板均为白色，其名由此而来［15］。白背飞虱整个生活史包括卵、若虫和成虫3个阶段，属于不完全变态，成虫有翅二型现象。该研究前期已测定获得了此虫的转录组数据，比对到全长1 377 bp的tramtrack基因cDNA开放阅读框序列（序列号c53168_c4_g1_i3），编码由458个氨基酸组成的蛋白质，笔者在此基础上分析白背飞虱Tramtrack蛋白的结构特点，并采用荧光定量 PCR 方法测定了该蛋白基因在受精卵和未受精卵，以及5龄若虫不同部位的表达水平。研究结果有助于了解水稻害虫Tramtrack蛋白的结构特点和表达水平，为进一步研究其在水稻害虫中的生物学功能奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

虫源采自广州市郊外的华南农业大学实验田，在室温（28±2）℃、 70 %相对湿度和16 h光照：8 h黑暗的条件下进行饲养。选取交配和未交配、且腹部肥大即将产卵的雌成虫各10头，在体式显微镜下分别解剖取出已成熟的卵，放入低温冰箱中保存待用。另外选取五龄第2天的雌若虫10头，先低温冷冻处理，再用刀片将所有虫体切成头部、胸部和腹部，然后收集各个部位的样品储存在低温冰箱中待用。以上样品重复3次。

1.2  Tramtrack蛋白的理化性质分析

利用网上软件 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）、SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）和NetPhos-3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）对白背飞虱Tramtrack蛋白的理化性质进行具体分析。

1.3  Tramtrack蛋白的三维结构预测

在网上软件Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）中提交白背飞虱Tramtrack蛋白的氨基酸序列，采用同源建模法模拟构建出Tramtrack三维结构。

1.4  定量PCR检测

采用Trizol试剂盒（Invitrogen，美国）从受精卵、未受精卵和5龄头、胸、腹的样品中分别提取总 RNA，再根据PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，日本）试剂盒的操作说明，分别反转录合成各样品的cDNA。设计出Tramtrack蛋白基因的引物（F：TCCTGGTTTGAAATCCCTT；R：CAACTCACCATCGCACAAT）。内参基因为β.actin（NCBI的登录号为NC_004354.4），试验使用的方法为SYBR green qRT-PCR。使用2-ΔΔCT法处理相关试验结果，数据处理和统计分析使用SPSS 26软件。

2  结果与分析

2.1  白背飞虱Tramtrack蛋白的理化分析

Tramtrack蛋白理论等电点为8.24，属于碱性蛋白。由图1可知，白背飞虱Tramtrack为亲水性蛋白。SignalP-5.0在线软件预测分析Tramtrack的SP 信号肽值为0.000 5，没有信号肽（图2）。Netphos 对Tramtrack的重要磷酸化位点进行分析，结果显示该蛋白有 42个丝氨酸、13个苏氨酸、5个酪氨酸位点（图3）。

2.2  白背飞虱Tramtrack蛋白的三维结构分析

建模得到的三维结构主要由α-螺旋构成，还有少部分的β-折叠（图4）。

2.3  编码Tramtrack蛋白的基因在白背飞虱卵和五龄若虫头、胸、腹中的表达

编码Tramtrack蛋白的mRNA在白背飞虱受精卵中含量显著高于未受精卵（图5）。在白背飞虱五龄若虫中，Tramtrack蛋白基因在胸部和腹部的表达量接近，差异不显著，但在头部的表达显著升高，与在胸部和腹部的表达相比差异显著（图6）。

3  结论与讨论

该研究在已获得的白背飞虱全长1 377 bp的tramtrack基因cDNA开放阅读框序列的基础上，对其编码的由458个氨基酸所组成的Tramtrack蛋白的结构特点进行生物信息学分析，结果显示，该蛋白等电点为8.24，属于碱性蛋白，无信号肽，为亲水性蛋白，有多个磷酸化位点，其三维结构主要是α-螺旋，少部分是β-折叠。这说明白背飞虱Tramtrack蛋白在結构上与其他物种的相关蛋白类似，进一步说明该类蛋白在不同物种中具有高度保守性［2］。这是第一次有关水稻害虫稻飞虱的Tramtrack蛋白的研究报道，为今后具体探究该蛋白在水稻害虫中的具体功能角色提供前期基础。

定量PCR检测表明在白背飞虱受精卵中tramtrack基因的表达明显高于未受精卵。由于卵内mRNA均来源于母体［16］，推测交配受精行为可能会增强母体tramtrack基因的表达，故受精卵中tramtrack的mRNA量高于未受精卵。具体情况还有待进一步证实。此外，定量PCR检测还发现tramtrack基因在五龄若虫头部表达显著高于在胸部或腹部表达。这与已有报道认为这个基因主要在头部神经系统表达和发挥作用相一致［8，10］。

参考文献

［1］刘坤，姬朝光，闫晓寒，等.BTB蛋白结构与功能研究进展［J］.现代生物医学进展，2019，19（7）：1367-1373，1366.

［2］ALBAGLI O，DHORDAIN P，DEWEINDT C，et al.The BTB/POZ domain：A new protein.protein interaction motif common to DNA.and actin binding proteins［J］.Cell growth and differentiation，1995，6（9）：1193-1198.

［3］SIGGS O M，BEUTLER B.The BTB.ZF transcription factors［J］.Cell cycle，2012，11（18）：3358-3369.

［4］BONCHUK A，DENISOV S，GEORGIEV P，et al.Drosophila BTB/POZ domains of “ttk Group” can form multimers and selectively interact with each other［J］.Journal of molecular biology，2011，412（3）：423-436.

［5］CHAHARBAKHSHI E，JEMC J C.Broad.complex，tramtrack，and bric.à.brac（BTB）proteins：Critical regulators of development［J］.Genesis，2016，54（10）：505-518.

［6］周畅，李麓芸.C2H2型锌指蛋白的研究进展［J］.生命科学研究，2004，8（3）：215-220.

［7］SIMON F，RAMAT A，LOUVET.VALLE S，et al.Shaping of Drosophila neural cell lineages through coordination of cell proliferation and cell fate by the BTB.ZF transcription factor Tramtrack.69［J］.Genetics，2019，212（3）：773-788.

［8］WOHL M，ISHII K，ASAHINA K.Layered roles of fruitless isoforms in specification and function of male aggression.promoting neurons in Drosophila［J］.eLife，2020，9：1-31.

［9］KNAPP E M，LI W，SUN J J.Downregulation of homeodomain protein Cut is essential for Drosophila follicle maturation and ovulation［J］.Development，2019，146（18）：1-16.

［10］ISHII K，WOHL M，DESOUZA A，et al.Sex.determining genes distinctly regulate courtship capability and target preference via sexually dimorphic neurons［J］.eLife，2019，9：1-34.

［11］SATO K，GOTO J，YAMAMOTO D.Sex mysteries of the fly courtship master regulator fruitless［J］.Frontiers in behavioral neuroscience，2019，13：1-7.

［12］CHENG D J，QIAN W L，MENG M，et al.Identification and expression profiling of the BTB domain.containing protein gene family in the silkworm，Bombyx mori［J］.International journal of genomics，2014，2014：1-15.

［13］HUANG J F，FANG L，WANG S，et al.Molecular cloning，expression profiling，and functional analysis of a broad.complex isoform 2/3（Br.Z2/Z3）transcription factor in the diamondback moth，Plutella xylostella（L.）［J］.Archives of insect biochemistry and physiology，2019，101（2）：1-19.

［14］ALI E，LIAO X，YANG P，et al.Sublethal effects of buprofezin on development and reproduction in the white.backed planthopper，Sogatella furcifera （Hemiptera：Delphacidae）［J］.Scientific reports，2017，7（1）：1-9.

［15］唐楠.白背飛虱基因组测序及其受南方水稻黑条矮缩病毒侵染的转录组分析［D］.合肥：中国科学技术大学，2017.

［16］杨梅，何静怡，林佳，等.昆虫母体效应基因功能研究进展［J］.应用昆虫学报，2020，57（3）：568-573.