高效液相色谱-紫外检测分析木槿花多糖水解单糖组分

孙盼盼，王静，曹际云

德州学院生命科学学院 （德州253023）

木槿，别名佛桑花、篱障花，是锦葵科木槿属，落叶灌木。其躯干高大，花朵长于枝端叶腋间，花萼和花均为钟形，淡紫色。外有纤毛和星状长柔毛。木槿原产于中国，大多数地区均有分布。其适应性强，耐高温耐寒冷。抗病虫能力强，病害较少，生命力顽强。木槿花性凉，味甘、苦。内服可清热解毒和润肺止咳，外敷可用于治疗疮疖、痈肿、烫伤的症状。它属于一味中药材，具有良好的医用价值。在我国的广东、浙江地区木槿花早已融入食材中，如用木槿花与小米或者玉米面熬粥，木槿花炒鸡蛋，或者作为配菜放入饼或肉汤里作为中装饰和提味[1]。

多糖是由10个以上的单糖分子缩合、失水而成的一类结构复杂的大分子物质，在自然界分布广泛，是生物体的重要组成成分。近年来，随着多糖研究的不断深入，多糖的分离、纯化、分析等取得非常大的进展。植物多糖是一种天然产物，种类繁多，来源广泛。已了解到的植物多糖生物学功能有免疫调节、降血糖。抗氧化、抗肿瘤和抗癌等[2-4]。基于多糖独特的理化性质和生物学功能，加上我国丰富的植物资源，多糖的科学研究势必有广阔发展前景。

高效液相色谱又称“高压液相色谱”，是以高压下的液体为流动相，样品各组分溶于流动相并经过固定相时，与固定相发生作用，通过组分在固定相停留的时间的不同，从而对组分进行定性。高效液相色谱法灵敏度高、稳定性好、分离效能高，已成为多糖的分离和测定的重要途径。

试验使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化法，对木槿花多糖和标准单糖进行高效液相色谱分析，对木槿花多糖水解单糖组分分析和含量进行鉴别和分析。木槿花多糖经3 mol/L盐酸水解后，与标准单糖进行PMP衍生化。采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1 mol/L的乙酸铵溶液（pH 6.9）和乙腈为流动相，在250 nm波长检测[5]。通过多糖各组分的滞留时间和标准品单糖的保留时间进行对比，对木槿多糖进行定性分析；建立标准品单糖的标准曲线，对木槿单糖进行定量分析[6]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UltiMate3000高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；TGL-16R型台式医用离心机（山东百欧医疗科技有限公司）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S-3L型油浴锅（江苏科技仪器公司）；PHS-3C型数显台式酸度计（苏珀仪器有限公司）。

苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（分析纯）、乙酸钠（色谱纯）：科密欧化学试剂有限公司；D-木糖、D-半乳糖、D-无水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-鼠李糖一水物（合肥博美生物科技公司）；甲醇、乙腈（均为色谱纯，天津市大茂化学试剂公司）；三氯甲烷（分析纯，北京化工厂）；所用水均为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖的制备

取木槿花粉末若干，置于索氏提取器中，对木槿花粉末进行脱脂处理，3 h脱脂3次后烘干备用。用适量蒸馏水溶解，放置与超声破壁机中，进行热水浸提，提取后进行抽滤，抽滤后得到浸提液，乙醇沉提并离心，得到多糖沉淀，用蒸馏水溶解多糖沉淀。加入一定体积正丁醇-氯仿进行除蛋白操作，在4 000 r/min转速下，离心15 min，弃去沉淀，得到木槿花多糖溶液。冷冻干燥，即为粗多糖。

1.2.2 多糖测定

1.2.2.1 色谱条件

C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），波长250 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃。流动相A为0.1 mol/L的乙酸铵溶液（pH 6.9），流动相B为乙腈（色谱纯）。流动相皆过膜（乙酸铵-水系膜0.45 μm，乙腈-有机系膜0.45 μm）且超声处理，超声功率设置为50 kHz，时间15 min。

1.2.2.2 木槿花多糖处理

称取10 mg经过除脂、除蛋白的木槿花粗多糖，加1 mL水溶解。加入1 mL的3 mol/L盐酸，涡旋振荡5 min。于110 ℃油浴1 h，冷却后，加入NaOH溶液将溶液调pH至中性，加入300 μL 0.5 mol/L的PMP溶液和200 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混匀振荡5 min，于70 ℃热水浴1 h。冷却到室温，加入0.5 mol/L盐酸调pH为中性。用1 mL的三氯甲烷进行萃取，振荡5 min，将离心机设置成6 000 r/min，离心5 min，离心后弃去氯仿层，如此重复3次，将上清液用0.22 μL水系膜过滤。超声15 min。

1.2.2.3 单糖与多糖衍生反应

将各标准单糖配制为10 mg/mL，分别取200 μL各标准单糖，分别加入300 μL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶液和200 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液。混匀振荡5 min，于70 ℃热水浴1 h。冷却到室温，加入0.5 mol/L盐酸调pH为中性。加入1 mL三氯甲烷溶液进行萃取，涡旋振荡5 min，进行离心（6 000 r/min，5 min），留上清液，重复3次，采用0.22 μL水系膜过滤。超声15 min，用于HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 多糖流动相的选择

取经过处理的木槿花多糖，采用不同比例的乙腈和乙酸铵溶液组成的流动相进行洗脱，结果如图1所示。第2种洗脱机制的出峰效果要好，分离度好；第1种洗脱机制出峰效果一般，分离度差；第3种洗脱机制出峰效果差，分离度一般。综上选择第2种洗脱机制乙酸铵-乙腈=80+20（V/V）进行多糖和各单糖的洗脱。

图1 木槿花多糖PMP衍生物HPLC

2.2 单糖衍生物HPLC定性分析

采用PMP衍生化法，制备一系列梯度浓度的7种标准品单糖试剂溶液，按照1.2.2.3步骤进行处理，并在1.2.2.1条件下进行HPLC定性分析，如图2所示，得到甘露糖、无水葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸7种单糖衍生物在HPLC中与背景物质的基线分离情况。图谱显示，单糖衍生物的紫外吸收峰信号与浓度呈正比。

图2 各标准单糖PMP衍生物的HPLC定性分析

2.3 线性关系、定量限与木槿多糖中各单糖的含量

得到各种标准品的峰吸收面积后，以单糖浓度和峰面积分为横、纵坐标建立线性回归方程，如表1所示。单糖的浓度与目标峰面积呈良好线性关系，相关系数R2在0.95～0.99（木糖R2为0.95，半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖的R2为0.99）之间。甘露糖、无水葡萄糖、半乳糖定限量为0.5 mg/kg，其他单糖定限量为0.05 mg/kg。通过线性方程得出，各单糖的质量浓度分别为0，0.028，0.137，0.150，0.107，0.192和0.065 mg/mL，继而得出木槿多糖中各单糖含量分别为0，0.3%，1.3%，1.4%，1.0%，1.8%和0.6%（表1）。

表1 7种单糖的线性方程、相关系数、多糖中单糖的浓度及含量

3 结论

利用柱前衍生化法建立多糖水解的HPLC-UV分析技术，分析木槿花多糖水解的组成和含量。研究并鉴别木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、无水葡萄糖7种单糖组分，将其应用于木槿花多糖提取液样品含量分析，结果显示7种单糖的含量为1.0%，1.3%，1.4%，0.6%，0，1.8%和0.3%。可得木槿花多糖中不含甘露糖，且鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖占比较多。与其他技术相比，HPLC-UV操作较为简单、检测稳定，可实现多糖多组分的定量分析，可为木槿花多糖水解单糖组分分析及含量的测定提供重要依据。