一种复合头皮营养液对小鼠毛发生长的影响

吴旭升 孙广 乐云辰

雄激素性脱发（androgeneticalopecia，AGA）是一种最常见的脱发类型，起始于青春期或青春后期，是一种进行性毛囊微小化的脱发疾病［1］。近年来，AGA 的发病率逐年上升，并且呈年轻化趋势，给患者带来极大困扰。AGA 的发病机制复杂，目前研究表明与遗传、免疫紊乱、激素水平、雄激素受体的分布、局部微环境、细胞因子等相关［2］。由性激素代谢异常、毛囊微环境炎症反应诱发毛囊微型化，被认为是AGA 发病的重要环节［3］。然而临床治疗选择仍然有限和缺乏，米诺地尔是脱发非手术治疗常用的外用药物，其有效性已得到临床的肯定，但也存在一定副作用［4］。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物是两种米诺地尔结构类似物，研究报道具有促进毛发生长的作用。因其良好的安全性，已经被批准用于个人头皮洗护产品［5］。另外，雄激素水平增高，毛囊菌群失调，内源性应激等因素都可能会导致毛囊微炎症。有研究显示，菌群的失调可能是微炎症的诱发因素［6］。因此，本研究在吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物的基础上引入益生元和后生元等微生态组合物组成复合头皮营养液，并通过动物实验对其防脱生发功效进行评估，以及探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 3～4 周龄健康雄性C57BL/6J 小鼠，SPF级，体质量约16～18 g，上海灵畅生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2018-0003。由浙江鹰旸医药研发有限公司屏障系统内饲养，实验饲养室许可证号：SYXK（浙）2021-0003。

1.2 主要试验药品与试剂 复合头皮营养液（杭州钛美生物科技有限公司，批号：2020051001，壹安态益生元头皮营养液）；米诺地尔搽剂2%（山西振东安特生物制药有限公司，批号：20210226）、米诺地尔搽剂5%（山西振东安特生物制药有限公司，批号：20210712）；丙酸睾酮（麦克林，批号：C13133859）。

1.3 主要器材 NikonEclipseE100 正置光学显微镜，日本尼康；Micro17R 低温高速离心，Thermo；YXQMG-202 脉动真空灭菌器，张家港华菱医疗设备股份公司；RM2016 病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；CMaxPlus 酶标仪，MD；纯水机、包埋机、染色机、组织摊平机等。

1.4 方法 取健康雄性C57BL/6J 小鼠，随机分为5 组，分别为正常组、AGA 模型组、2%米诺地尔组、5%米诺地尔组和复合头皮营养液组，每组各12 只。将小鼠后背约2 cm×3 cm 区进行脱毛处理。除正常组外，其余小鼠均皮下注射丙酸睾酮溶液5 mg/（kg·d），连续注射30 d 构建雄激素型脱发模型，每次注射1 h 后分别涂抹2%、5%米诺地尔和壹安态益生元头皮营养液，1 mL/次，2 次/d，连续30 d；正常对照组及模型组均予外用生理盐水。

1.5 观察指标及测定 （1）小鼠背部毛发生长情况观察及评分：观察每个时间段各组小鼠背部在表皮颜色变化、皮肤过敏反应和毛发生长情况，拍照记录并评分。毛发生长评分标准：0 分：未观察到毛发生长；1 分：≤20%区域毛发生长；2 分：＞20%～40%区域毛发生长；3 分：＞40%～60%区域毛发生长；4 分：＞60%～80%区域毛发生长；5 分：＞80%区域毛发生长。（2）毛囊组织病理学观察试验：第30 天取背部给药区域皮肤（面积约1 cm×1 cm），进行常规组织脱水，石蜡包埋，HE染色。通过显微镜进行毛囊组织形态学观察并评分。见表1。

表1 组织病理学毛发生长评分标准

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件。计量资料若符合正态分布且符合方差齐性检验，用One-way-ANOAY 单因素方差分析；若符合正态分布但方差不齐，则采用Dunnett’s T3 检验或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用Kruskal-WallisH检验。所有数据以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠毛发生长情况观察结果 给予丙酸睾酮和实验药物试验观察期间，各组小鼠背部脱毛区，未见红斑、水肿、水疱等皮肤刺激症状。第7 天，正常组小鼠背部毛发生长速度较快，已覆盖大部分脱毛区；模型组小鼠见明显毛发生长；各试验组小鼠均可见不同程度新生毛发。第14 天，正常组小鼠背部毛发已覆盖脱毛区；模型组小鼠有部分毛发生长；各试验组小鼠新生毛发继续增加。第30 天，正常组小鼠背部毛发已全部长好，乌黑有光泽，模型组小鼠还有部分区域未完全长好，各试验组小鼠背部毛发已几乎全部长好，毛发浓密。见图1。对各组毛发生长进行评分，第7 天，第14 天，第30 天时，与正常组比较，模型组小鼠毛发生长评分显著降低（P＜0.05）；第7 天，5%米诺地尔组毛发生长评分显著高于2%米诺地尔组和复合头皮营养液组；第14 天和第30 天，复合头皮营养液组毛发生长评分均显著高于2%米诺地尔组（P＜0.05），与5%米诺地尔组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图1 小鼠毛发生长情况

图2 小鼠毛发生长评分

2.2 皮肤毛囊组织形态学观察及毛囊数目检测 HE染色结果显示：与正常组对比，模型组毛囊数明显减少；与模型组对比，复合头皮营养液组和5%米诺地尔组毛囊数量较多，分布比较密集，毛囊位于皮下组织深层；复合头皮营养液组和5%米诺地尔组生长期增生状态无显著性差异，且优于2%米诺地尔组。见图3。同时，通过对各组皮肤组织HE 半定量评分，对比模型组，2%米诺地尔组评分显著下降（P＜0.05），复合头皮营养液组和5%米诺地尔组评分显著下降（P＜0.01）。见图4。

图4 小鼠HE评分

3 讨论

局部用米诺地尔经FDA 批准用于男性和女性的雄激素性脱发，米诺地尔通过多种途径发挥作用（血管扩张剂、抗炎剂、Wnt/b-连环蛋白信号通路的诱导剂、抗雄激素），还可能影响毛囊生长期和休止期的长度［7］。吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物是两种米诺地尔结构类似物，分子结构中都含有二氨基嘧啶结构。研究显示，该两种化合物均体现了对人成纤维细胞中LHmRNA 表达的高抑制作用，抑制赖氨酰羟化酶的活性，与米诺地尔作用相当［8］。另外，一项多中心双盲临床研究，局部应用二氨基嘧啶氧化物对维持头发密度有积极作用，并显著抑制季节性脱发［9］。本研究中采用了含有吡咯烷基二氨基嘧啶氧化物和二氨基嘧啶氧化物两种结构类似物组合物的复合头皮营养液，在雄激素型脱发小鼠实验中同样观察到促进毛发生长的作用，与以往的研究结果一致，并且效果优于2%的米诺地尔，与5%的米诺地尔相当。研究结果提示该组合物可作为脱发患者非药物治疗方案的选择。

目前越来越多的研究发现，皮肤微生物群与多种皮肤病相关。头皮毛囊深入皮肤并携带不同于皮肤表面微生物群的复杂微生物群落。局部微生态失衡可能破坏皮肤的屏障功能，导致各种头皮毛发疾病［10］。进一步研究提示，毛囊微环境炎症反应诱发的毛囊微型化，而毛囊漏斗部的亲脂性微生物可能是毛囊微炎症的触发因素［3］，而痤疮丙酸杆菌和马拉色菌是两种皮肤常驻的亲脂性优势菌。一项研究证实，AGA 患者头皮微生物中两种亲脂性的微生物丰度显著高于正常人群［11］。免疫反应相关基因如Toll 样受体2、β 防御素1、干扰素调节因子1、单核细胞表面标记CD14 和朗格汉斯细胞表面标记CD1a/CD207 在微小化毛囊中表达均增加［12］。同时与枕部头皮和健康对照组比较，AGA 患者头顶脱发区球形马拉色菌和限制性马拉色菌的丰度均增加［13］。这些研究均提示了头皮菌群紊乱与AGA 可能有着潜在的联系，而改善头皮微生态环境的失衡可能是AGA 治疗的基础环节。这也为下一步实验设计提供思路，对头皮微生态环境在AGA 治疗中的作用进行深入探讨。

综上所述，采用了含有两种二氨基嘧啶氧化物衍生物和微生态调节成分的复合头皮营养液，在雄激素型脱发小鼠中具有防脱生发作用，这种双通路的机制也许是AGA 治疗的一种新的策略。