基于TCGA数据库分析MEAK7在非小细胞肺癌中的表达和临床意义

徐凯丽 吕昕*

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国肺癌的发病人数和死亡人数均居恶性肿瘤首位［1-2］。目前肺癌预后预测主要依赖于组织病理学诊断和肿瘤分期系统，但这不足以准确评估预后［3］。TCGA 数据库已被广泛应用于科研工作。本研究利用数据库中1,149 个非小细胞癌样本的转录组测序数据构建Cox 比例风险回归模型，可用于非小细胞肺癌预后风险评估［4］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是PI3K 相关蛋白激酶家族中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR 主要通过调节膜蛋白运输、蛋白质降解、蛋白激酶C 信号以及核糖体合成等途径，参与细胞生长与增殖的调控。其中，mTOR 可通过激活PI3K/AKT/mTOR 和AKT/TSC1-TSC2/mTOR 信号通路实现上述调节效应［5］。在包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种肿瘤中mTOR 呈激活状态。有实验数据显示PI3K/AKT/mTOR 通路在NSCLC样本中存在激活。通过免疫组化可见，NSCLC 切除组织中PI3K、AKT 和mTOR 的磷酸化水平较正常细胞显著升高［6］。MEAK7 是mTOR 的相关蛋白，其可模拟雷帕霉素在人类细胞中的作用机制激活mTOR 信号传导。作为mTOR 的必需互作蛋白，MEAK7 通过MTB 结构域与mTOR 结合，将信号传导至溶酶体并参与mTOR 的溶酶体靶向募集［7］。然而MEAK7 在非小细胞肺癌肿瘤中的表达及其与NSCLC 患者生存关系研究鲜有报道［8］。

1 资料与方法

1.1 数据来源 从Genomic Data Commons（GDC）数据门户网站（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载癌症基因组图谱（TCGA）数据库肺癌基因转录组数据及临床数据，用Perl 软件（5.32.1.1 版本）将数据进行整理并将转录组数据与临床数据进行整合，最终收集肺鳞癌和肺腺癌的mRNA 表达谱和临床数据1,149 例（包括肺腺癌598 例，肺鳞癌551 例）。

1.2 基因表达差异分析 MEAK7 的表达分组比较通过R 软件包ggplot2（3.3.3 版本）进行实现，Wilcoxon 秩和检验分析结果显示，P值＜0.05 被认为具有统计学意义。

1.3 生存分析 采用对数秩检验进行生存分析，临界值设定在MEAK7 的中位表达水平。单变量和多变量Cox 回归分析用于评估临床变量对患者结局的影响。将单因素Cox 回归分析中的预后变量P＜0.1 输入到多变量Cox 回归分析中。R 包ggplot2 用于可视化作图。

1.4 列线图的构建和验证 为了预测总生存概率，在多变量Cox 分析中建立了基于独立预后因素的列线图。然后使用校准图来评估列线图的性能，并使用一致性指数（C 指数）来量化列线图。列线图和校准图是使用R包RMS 创建的，使用timeROC 包执行随时间变化的受试者工作特征（ROC）曲线以评估预测精度。

1.5 基因表达相关性分析 基因相关性图通过R 软件包ggplot2（3.3.3 版本）进行实现，使用Spearman 的相关分析来描述-正态分布的定量变量之间的相关性。分析数据中两两变量之间的相关性，并使用circlize 包对相关性结果进行可视化。

1.6 统计分析 所有统计分析均使用R（版本3.6.3）进行，采用Wilcoxon 秩和检验和配对样本t检验分别评估MEAK7 在非配对和配对组织中表达的统计学意义。采用Wilcoxon 秩和检验和Logistic 回归法评估临床特征与MEAK7 表达之间的相关性。所有检验均为双侧检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌患者临床资料及MEAK7 表达的单因素及多因素Cox 分析 见表1。

表1 非小细胞肺癌患者临床资料及MEAK7表达的单因素及多因素Cox分析

2.2 MEAK7 在肿瘤中表达情况 应用TIMER2 方法分析MEAK7 在TCGA 中的各种癌症类型中的表达水平。MEAK7 在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、胆管癌（CHOL）、结肠癌（COAD）、食管癌（ESCA）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌（PRAD）、直肠腺癌（READ）、胃癌（STAD）等18 个肿瘤组织中的表达水平均高于相对应的正常组织（P＜0.05）（图1A）。差异表达分析结果显示，与正常癌旁组织相比，MEAK7 在肺非小细胞癌组织中明显上调（P＜0.05）。配对差异分析结果表明，与相邻正常的组织相比，肺癌组织中MEAK7 处于高表达。综上，所有结果均显示MEAK7 在肿瘤中的表达水平明显高于正常组织，表明MEAK7 可能是影响肺癌预后的潜在关键基因（图1B、1C）。作者又进一步通过ROC 曲线评估预测我们实验的准确性，AUC 结果为0.815，进一步证明了实验的准确性（图1D）。

图1 在不同类型肿瘤和肺癌中的MEAK7表达水平。A. 与TCGA和GTEx数据库中的正常组织相比，MEAK7在不同类型的肿瘤中的表达；B. 在TCGA和GTEx数据库的非小细胞肺癌和正常组织中；C. 在非小细胞肺癌和TCGA数据库中的匹配正常组织；D. TCGA数据库中非小细胞肺癌与正常组织分类的ROC曲线

2.3 基于临床特征分析MEAK7 表达 通过对临床样本数据分析，在不同临床表型的分布情况可以看出，肺癌中MEAK7 的高表达与分期、分级和年龄等临床特征显著相关。结果显示，MEAK7 表达随着T、M 分期进展而升高；同时与淋巴结浸润相关；同时，MEAK7 表达与年龄正相关；吸烟患者的MEAK7 表达亦明显高于不吸烟患者；男性患者的MEAK7 表达高于女性；同时在生存状态的亚组间有显著的差异。见图2。

图2 基于临床特征分析MEAK7表达。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.4 MEAK7 对肺癌患者的预后影响 利用风险模型结合临床特征肿瘤TNM 分期、年龄、性别分级构建列线图（图3A）。校准曲线显示，校正曲线接近理想曲线，表明列线图模型预测结果与实际结果有较好的一致性（图3B）。进一步通过ROC 曲线（1、3、5 年）评估预测实验的准确性（图3C）。在Kaplan-Meier 曲线分析的结果中均显示，MEAK7 的高表达与患者的低OS、DSS 相关，且结果均具有统计学意义（图3D、3E）。

图3 MEAK7对肺癌患者的预后影响。A：利用风险模型结合临床特征肿瘤TNM分期、年龄、性别分级构建列线图；B：校准曲线表明列线图模型预测结果与实际结果有较好的一致性；C：通过ROC曲线（1、3、5年）评估预测实验的准确性；D、E：在Kaplan-Meier曲线分析基于OS、DSS相关，且结果均具有统计学意义（图D、E）

2.5 MEAK7 相关结合蛋白的相互作用网络 为了进一步研究MEAK7 基因在肿瘤发生中的分子机制，筛选出了MEAK7 的靶向结合蛋白和MEAK7 表达相关基因，最终获得了20 个MEAK7 相关结合蛋白。见图4。

图4 MEAK7相关结合蛋白的相互作用网络。A：20个MEAK7相关结合蛋白的相互作用网络；B：MEAK7与这20个蛋白的共表达热图

3 讨论

MEAK7 是mTOR 信号的阳性调节因子，在人类细胞中通过S6K2/4E-BP1 轴发挥作用［9］。MEAK7 在转移性人类癌症中显著表达，并形成一种新的涉及DNAPK 的mTOR 复合物，以促进S6K2 信号传导并抑制4EBP1。研究表明，mTOR 信号异常会导致神经系统疾病如进行性肌阵挛性癫痫、癌症等多种疾病，因此更全面地了解mTOR 和MEAK7 的相互作用可能对预防或治疗这些人类疾病很重要［10］。mTOR 是磷脂酰肌醇-3 激酶相关激酶（PIKK）家族的成员。能有效调节细胞代谢、DNA 修复途径和基因组监测。mTOR 信号传导由两种多蛋白复合物定义［11］。溶酶体是mTOR 信号传导的重要细胞区室。MEAK7 锚定在溶酶体膜上，并与DNA PK形成替代mTOR 复合物，以调节mTOR 信号［12］。

本研究基于TCGA 数据库，初步探究了MEAK7 在NSCLC 患者中的预后和表达以及相关结合蛋白。初步结果表明，MEAK7 在NSCLC 中高表达；肿瘤分期越高，MEAK7 表达越高；高表达MEAK7 的NSCLC 患者总生存期低。作者也探索了与MEAK7 相关基因以及存在潜在相互作用的蛋白最终获得了20 个与MEAK7 相关结合蛋白。本研究采用了多种生物信息学方法，处理了大量数据并进行分析，但目前的研究仅限于运用数据库相关数据进行研究及验证，接下去作者将展开MEAK7 在NSCLC 中的调节作用的基础实验等方面研究。