PAK1在幽门螺杆菌联合MNNG诱导人食管上皮细胞分泌IL-8和GRO-α中的作用

郭雨松 李思瑶 陈艳*

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康与生命。根据全球癌症统计（global cancer statistics，GLOBOCAN）数据显示，2020 年我国食管癌新发病例数为324,422例，死亡病例数为301,135 例，分别占全球食管癌新发病例和死亡病例的53.70%和55.35%［1］。亚硝胺类化合物具有极强的致癌作用，N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）是一种具有较强诱变及致癌能力的人工合成化合物，常被用于化学致癌物诱变机理的研究［2］。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）已被证实与众多消化系统疾病的发生密切相关，但其与食管癌的相关性研究甚少。近年来，炎症与肿瘤之间的关系愈发成为研究热点。本课题组前期通过Agilent Human LncRNA芯片检测DNMT1 高表达食管上皮细胞和正常细胞株差异表达的LncRNA 和mRNA，结合生物信息学技术和共表达网络分析发现LncRNA TUG1 的异常表达与幽门螺杆菌感染的上皮信号通路有关［3-4］，而PAK1（p21-activated protein kinase 1）为该信号通路的关键因子。CXCR2 是与PAK1 相关的趋化因子受体之一，可参与肿瘤细胞增殖、引起细胞运动及促血管生成［5］，其中最知名的配体是IL-8（CXCL8）和GRO-α（CXCL1）。本研究通过制备RNAi和过表达慢病毒并感染人食管上皮细胞构建PAK1 低、高表达HEEC 稳定细胞株，探讨PAK1在HP 联合MNNG 诱导人食管上皮细胞分泌趋化因子IL-8、GRO-α 中的作用，以期为食管癌的发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人食管上皮细胞系（HEEC）购自宝信生物公司（中国武汉），内参基因、目的基因引物由上海吉凯公司设计与合成，工具载体GV112、GV341 购自上海吉凯公司。幽门螺杆菌标准菌株（ATCC26695）来源于广东省微生物菌种保藏中心，MNNG 分析纯购自上海罗恩公司，PMI1640 培养基购自美国HyClone 公司，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）、0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液均购自美国Gibco 公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自北京索莱宝公司，布氏肉汤购自杭州微生物试剂有限公司，甘油三酯购自广东西陇科学试剂公司，RNAiso Plus、PrimeScript™ RT Master Mix（Perfect Real Time）和TB Green® Premix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）均购自日本Takara 公司。GRO-α 及IL-8 ELISA 试剂盒购自欣博盛公司。

1.2 仪器 CO2恒温孵育箱、生物安全柜和超低温冰箱购自美国Thermo Scientific 公司，生物超净台购自上海天呈公司，低速自动平衡离心机购自北京京立公司，低温离心机购自德国Eppendorf 公司，生物厌氧培养箱购自浙江义乌冷冻机总厂，紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，PCR 仪（Mastercycler）和Realtime PCR 仪（RealpleX2）均购自德国Eppendorf 公司。

1.3 方法 （1）PAK1 低表达HEEC 稳定细胞株的构建：通过制备RNAi 慢病毒并感染HEEC 构建PAK1 低表达稳定细胞株（PAK1-KD）。引物由上海吉凯公司设计与合成、工具载体GV112 购自上海吉凯公司。具体步骤为设计目的基因干扰靶点→干扰靶点克隆构建至病毒载体上→测序确保靶点序列一致→质粒扩增、质检→质粒转染细胞包装病毒→病毒收获、浓缩、纯化→病毒质检、分装→慢病毒预感染→病毒感染→目的基因的干扰效率检测。引物序列见表1、2。（2）PAK1 高表达HEEC 稳定细胞株的构建：通过制备过表达慢病毒载体并感染HEEC 构建PAK1 高表达HEEC 稳定细胞株（PAK1-OE）。目的基因引物由上海吉凯公司设计与合成、工具载体GV341 购自上海吉凯公司。具体步骤为设计目的基因获取→重组质粒构建至病毒载体上→测序确保序列一致→质粒扩增、质检→质粒转染细胞包装病毒→病毒收获、浓缩、纯化→病毒质检、分装→慢病毒预感染→病毒感染→目的基因过表达效率检测。目的基因引物序列见表3。（3）细胞染毒：PAK1-KD 和PAK1-OE 细胞分别分为HP+MNNG 联合染毒组、HP 染毒组和MNNG 染毒组并设立空白对照组，共8 组。将PAK1-KD/ PAK1-OE 细胞接种于6 孔板中，当细胞铺满70%～80%瓶底面积时，按感染复数（MOI）=100 ∶1，即细菌∶细胞=100 ∶1 加入至细胞中进行共培养，加入MNNG 溶液至终浓度为IC50［6］进行染毒。（4）IL-8、GRO-α 含量的测定：各组细胞染毒3 h、6 h 和9 h 后弃去上清液，用PBS 清洗3 次，用含庆大霉素的无血清培养基培养48 h 后做支原体检测，避免支原体污染，收集上清液，严格按ELISA 试剂盒说明书方法进行测定，每组设3 个复孔。

表1 PAK1 RNAi靶点

表2 PAK1 RNAi合成引物信息

表3 PAK1合成引物信息

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 统计学软件。计量资料进行正态性检验，均为正态分布，采用（±s）进行统计描述。两独立样本间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 法。用Graphpad Prism 8 绘图软件绘图。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 HEEC PAK1 低、高表达稳定株的构建 经实时荧光定量PCR 验证，与PAK1-NC 组相比，PAK1-KD 基因敲减效率达84.1%（t=14.627，P=0.004），PAK1-OE组PAK1 基因的表达丰度是PAK1-NC 组的1,101.646 倍（t=16.104，P=0.004），见表4，图1。表明成功构建了PAK1 低、高表达人食管上皮细胞稳定株。2.2 PAK1 在HP 联合MNNG 染毒促进细胞IL-8 分泌中的作用 PAK1-KD 与PAK1-OE 细胞染毒3 h、6 h和9 h 后，各染毒组细胞IL-8 含量随染毒时间增加，经趋势性检验线性趋势显著（PAK1-KD 细胞：F对照组=2.682，P=0.153；FMNNG=20.425，P=0.004；FHP=40.862，P=0.001；FHP+MNNG=25.181，P=0.002。PAK1-OE 细胞：F对照组=2.190，P=0.189；FMNNG=39.286，P=0.001；FHP=36.478，P=0.001；FHP+MNNG=193.692，P＜0.001）。相同染毒时间，各组细胞IL-8 含量差异有统计学意义（PAK1-KD 细胞：F3h=126.292，P＜0.001；F6h=281.997，P＜0.001；F9h=232.455，P＜0.001。PAK1-OE 细胞：F3h=486.373，P＜0.001；F6h=588.701，P＜0.001；F9h=378.793，P＜0.001），且均出现联合染毒组＞HP 染毒组＞MNNG 染毒组＞对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。相同染毒时间，与PAK1-KD 相比，PAK1-OE 显著促进联合染毒组、HP 染毒组和MNNG 染毒组细胞分泌IL-8（联合组：t3h=3.377，P=0.028；t6h=3.017，P=0.039；t9h=3.394，P=0.027；HP 染毒组：t3h=2.863，P=0.046；t6h=2.909，P=0.044；t9h=3.629，P=0.022；MNNG 染毒组：t3h=2.964，P=0.043；t6h=3.014，P=0.040；t9h=2.837，P=0.047）。对照组间无显著差异（均P＞0.05）。见图2。说明PAK1 高表达可以促进HP 联合MNNG 诱导人食管上皮细胞分泌IL-8。

图1 PAK1低、高表达HEEC稳定细胞株构建效率。注：与NC组比较，*P＜0.01

图2 PAK1 对各处理组不同染毒时间细胞分泌IL-8 的影响。注：与对照组比较，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001；与HP+MNNG 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与HP 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

表4 慢病毒感染后PAK1基因相对表达量［（±s），2-ΔΔCt］

表4 慢病毒感染后PAK1基因相对表达量［（±s），2-ΔΔCt］

注：细胞标记说明：NC-空载体对照组、KD-低表达组、OE-高表达组

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2.3 PAK1 在HP 联合MNNG 染毒促进细胞分泌GRO-α 中的作用 PAK1-KD 与PAK1-OE 细胞染毒3 h、6 h 和9 h 后，各染毒组细胞GRO-α 含量均随染毒时间增加，经趋势性检验线性趋势显著（PAK1-KD细胞：F对照组=2.679，P=0.153；FMNNG=38.283，P=0.001；FHP=28.980，P=0.002 ；FHP+MNNG=121.938，P＜0.001。PAK1-OE 细胞：F对照组=0.597，P=0.469；FMNNG=58.925，P＜0.001 ；FHP=40.543，P=0.001 ；FHP+MNNG=246.745，P＜0.001）。相同染毒时间，各组细胞分泌GRO-α 含量差异有统计学意义（PAK1-KD 细胞：F3h=226.755，P＜0.001 ；F6h=835.844，P＜0.001 ；F9h=1182.142，P＜0.001。PAK1-OE 细胞：F3h=1523.939，P＜0.001；F6h=675.016，P＜0.001；F9h=1654.557，P＜0.001），且均出现联合染毒组＞HP 染毒组＞MNNG 染毒组＞对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。相同染毒时间，与PAK1 低表达相比，PAK1 高表达显著促进联合染毒组、HP 染毒组和MNNG 染毒组细胞分泌GRO-α（联合组：t3h=6.645，P=0.004；t6h=9.059，P=0.012；t9h=11.523，P＜0.001；HP 染毒组：t3h=3.014，P=0.039；t6h=4.034，P=0.016；t9h=3.519，P=0.024；MNNG 染毒组：t3h=3.308，P=0.030；t6h=3.091，P=0.037；t9h=4.063，P=0.015）。对照组间无显著差异（均P＞0.05）。见图3。说明PAK1 高表达可以促进HP 联合MNNG 诱导人食管上皮细胞分泌GRO-α。

图3 PAK1 对各处理组不同染毒时间细胞分泌GRO-α 的影响。注：各组与对照组比较，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001；各组与HP+MNNG 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；各组与HP 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

3 讨论

食管癌是一种与炎症相关的疾病，炎症在食管癌的发生、发展中发挥重要作用。有研究表明亚硝胺类化合物是食管癌的重要致病因素，NF-κB 通路通常在MNNG 诱导食管炎中起关键作用［7］。此外，某些细菌产物如HP 亦具有促肿瘤作用，当机体受到细菌感染时会引起促炎介质释放增加，进而改变趋化因子和细胞因子的表达，促进细胞生长与侵袭，导致肿瘤的发生［8］。已有研究表明HP 可导致慢性胃炎，并增加消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃癌的发病风险［9］，然而关于HP 与食管癌的相关性研究甚少，且结论也不一致。吉胜利等［10］研究HP 感染与食管鳞癌相关性时，发现在食管鳞癌患者组中HP 感染阳性率最高，明显高于重度不典型增生患者组、轻-中度不典型增生患者组、慢性食管炎患者组和轻度不典型增生患者组，提示HP 感染可影响食管鳞癌的发生与发展。研究［11］表明HP 感染可提高食管癌细胞的增殖能力，导致细胞形态不规则及细胞间隙扩大，促进食管癌的发生、发展。PAK1 作为HP 感染上皮信号通路中的重要分子，其激活可引发下游IL-8、GRO-α 和其他中性粒细胞趋化因子的改变［12］，引起促炎反应及趋化效应，促使肿瘤的发生。TRAN 等［13］研究表明HP 可通过EGFR、MAPK 和JAK/STAT 信号通路诱导趋化因子GRO-α 和IL-8 的表达。IL-8 及其受体在肿瘤的发展过程中发挥了关键作用，IL-8 可与其受体CXCR1 及CXCR2 相互作用参与肿瘤细胞增殖［14］、促进血管生成及诱导炎症反应等。范玉宏等［15］研究发现在食管鳞癌患者组织中GRO-α 及其受体CXCR2 的mRNA 和蛋白表达水平显著高于正常组织，说明食管黏膜在发生癌变过程中，GRO-α 和CXCR2 参与启动趋化过程来介导食管鳞癌的发生。作为癌症发展过程中的重要趋化因子，IL-8 和GRO-α 可通过与CXCR2 受体相结合的方式，参与激活TAK1/NF-κB 信号传导［16］，促进癌细胞的增殖和转移。

PAK1 是一个潜在的癌基因，目前已在多种人类恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、淋巴瘤及黑素瘤等中观察到PAK1 基因和PAK1 蛋白的过度表达［17］，其在调节细胞周期、细胞运动、存活和细胞生长信号转导、转化方面发挥关键作用［18］。本研究发现，PAK1 高表达显著促进了HP 联合MNNG 诱导人食管上皮细胞分泌趋化因子IL-8 和GRO-α，有理由认为HP 联合MNNG 可激活PAK1，引起下游炎症趋化因子IL-8 和GRO-α 分泌增加，引发食管癌相关不良反应。

由于食管癌发生的复杂性，本研究采用短期染毒方法，仅在分子水平观察到PAK1 对HP 联合MNNG 诱导的趋化因子IL-8 和GRO-α 的调控作用，在以后的研究中，需增加更长染毒时间点或慢性染毒人食管上皮细胞，以深入探讨PAK1 在HP 联合MNNG 致食管癌发病中的作用机制。