胶原蛋白自组装光谱检测方法研究进展

范行良 赵子希 陈亮 中国食品药品检定研究院 （北京 102629）

内容提要： 胶原蛋白结构是其功能特性的基础，而胶原蛋白自组装过程是结构形成的关键环节。通过紫外-可见光、浊度法、荧光分度法、红外光谱、圆二色光谱术和核磁共振波谱法等方法可对胶原蛋白自组装过程进行监测和评价，并可用于建立胶原蛋白类医疗产品质量控制和评价有效方法。

胶原蛋白是细胞外基质中重要的结构蛋白，不同组织中分布的不同类型胶原蛋白具有独特功能[1]。例如，Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤中，主要功能之一是为组织提供机械支撑以确保其完整性和弹性，通过胶原纤维提供抗拉强度来防止撕裂并保持弹性。胶原蛋白类医疗产品预期利用胶原蛋白的各种功能特性，除机械支持外，胶原蛋白还积极参与细胞-基质相互作用，并影响诸如细胞黏附、信号转导、组织稳态调节、炎症反应、血管生成以及纤维化和疤痕等方面的细胞行为。而胶原蛋白结构是其功能特性的基础，因此，对胶原蛋白结构形成的关键自组装过程及其相关表征方法进行研究可作为组织提取胶原蛋白质量控制和评价关键指标，对重组胶原蛋白也可作为蛋白设计和性能验证的重要方法。本文概述了可用于胶原蛋白自组装表征的光谱检测方法进展。

1.胶原蛋白的结构

胶原蛋白各级结构的自组装形成过程，包括α-螺旋、三螺旋以及更为典型的自组装形成的胶原原纤维，决定了胶原蛋白的结构功能。胶原蛋白α-肽链由氨基酸残基组成线性链，其自组装通过氢键、范德华力和疏水相互作用在链两侧氨基酸残基间发生，从而稳定α-螺旋结构，并由三条α-肽链互相缠绕形成右手螺旋结构。在此基础上，三股螺旋的胶原分子通过侧连，自组装形成有序排列的直径约50～200nm的胶原原纤维，并进一步形成胶原纤维。

2.生理状态下的胶原蛋白自组装过程

为了发挥其功能，构成蛋白质的氨基酸链必须以特定方式排列，这被称为蛋白质自组装。自组装是通过位于链两侧的氨基酸残基之间的化学吸引力而发生的。这些化学键将蛋白质结合在一起，并提供整体结构所需的稳定性。胶原蛋白由长线性氨基酸链组成，在细胞内质网中首先合成前胶原链，其中包含多个Gly-Pro-Hyp重复序列形成长线状结构。然后进行赖氨酸和羟脯氨酸残基的羟基化修饰，这些修饰对于三螺旋结构的稳定至关重要。随着前胶原分子裂解为单体-原胶原，原胶原分子会自发地折叠成三螺旋结构，并进一步聚合形成纤维最终形成胶原纤维。同时，单体也会横向聚集生成纤丝。整个自组装过程可以分为静滞期（核心期）、生长期（快速增长期）和平衡期（平台期）等三个阶段[2]。自组装过程是形成复杂胶原基质不可或缺的核心过程，在支撑人体各种组织完整性和功能方面起到关键作用。

3.胶原蛋白自组装的表征

表征胶原蛋白自组装是一个复杂的多维过程，涉及研究胶原蛋白分子在组织成高阶结构时的分子、结构、机械和生物特性。胶原蛋白是各种组织细胞外基质中含量最高的蛋白质，在提供结构完整性、机械强度和组织支撑方面发挥着至关重要的作用。了解胶原蛋白的自组装对揭示其在组织发育、维护和修复中的作用至关重要。光谱学表征是研究胶原蛋白自组装的重要手段，包括紫外-可见光、浊度法、荧光分度法、红外光谱、圆二色光谱术和核磁共振波谱法等。通过这些方法可以了解胶原蛋白的二级和三级结构、氢键和分子相互作用，并监测自组装的过程。

3.1 紫外-可见光谱

紫外-可见光谱测量分子对紫外光和可见光的吸收，其特定波长可能因分子结构而变化。虽然胶原蛋白本身没有独特的发色团，但其中某些氨基酸残基可以促进在紫外-可见光范围内的吸光度。当光穿过样品时，某些波长被样品分子中的发色团（产生颜色的基团）吸收，导致吸光度发生变化。胶原蛋白自组装会使发色团环境发生变化，从而影响其吸光度。因此，通过分子相互作用引起的吸光度变化来监测胶原蛋白的自组装是可行的。芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸是胶原中两个重要的发色团，二者分别在280nm和275nm左右有最大吸收峰。然而，在胶原中这两种氨基酸含量较少，所以胶原蛋白在200～240nm处具有最大吸收峰[3]。这与多肽链上C=O、-COOH和-CO-NH2基团有关[4]。M.Ramesh Kumar等[5]在研究电化学制造过程中胶原膜机械性能与聚集过程关系时，使用了紫外/可见光谱来观察沉积后电解质相对于纯水的变化。结果显示，在200nm（肽键）和300nm（芳香族氨基酸侧链）附近宽峰强度随着电合成时间增加而减小，表明更多胶原蛋白参与形成了胶原膜纤维。紫外/可见光谱法具有以下优点：①高通量：可以快速分析多个样品；②非破坏性：不会改变样品；③易操作：仪器设置简单且易于操作；④定量分析：提供了关于吸光度变化数量信息；⑤动力学监测：适用于实时监测自组装过程。然而该方法也存在以下不足之处：①结构信息受限：提供的分子结构和相互作用信息有限；②灵敏度不足：可能不足以检测细微的结构变化；③蛋白质聚集：可能受到蛋白质聚集和散射的影响。此外，胶原蛋白在紫外-可见光范围内的吸光度受到多种因素的影响，包括色氨酸和酪氨酸残基的数量、它们的局部环境以及其他分子的存在。这些吸收峰可用于监测自组装过程中胶原蛋白构象和相互作用的变化，但确切的波长可能会根据具体样品和条件而有所不同。

3.2 浊度法

浊度法是通过胶原蛋白溶液的浊度-时间曲线来反映自组装的过程。凝胶蛋白肽自组装时，溶液变化包括“溶液-浊液-凝胶”的三个过程[2]。在检测波长方面，Mingyan Yan等[6]分别采用313nm和400nm波长研究狭鳕鱼皮和罗非鱼胃蛋白酶溶解型胶原蛋白自组装[7]。曾泉[8]用分光光度法在313nm波长检测胶原蛋白成纤维的动力学，说明不同样品可以用不同波长来检测自组装。

浊度法受到的干扰因素较多。浓度是影响胶原蛋白自组装的重要因素。狭鳕鱼皮胶原蛋白自组装的临界浓度为0.3～0.6mg/mL，0.6mg/mL以上狭鳕鱼皮胶原蛋白进行自组装。0.6mg/mL浓度样品静滞期最长，2mg/mL浓度样品静滞期、生长期增长斜率和最大吸光度值均高于1mg/mL。由于吸光度值与胶原纤维的直径正相关，胶原纤维直径越大，吸光度越高，这提示只有在最适浓度条件下，胶原蛋白自组装形成的胶原原纤维直径最大。

pH对胶原蛋白具有重要的影响。在不同pH溶液中，胶原蛋白一些功能基团的电荷会发生改变，从而影响胶原蛋白自组装。在pH7.0～7.6范围内，狭鳕鱼皮胶原蛋白可以形成自组装，而且在接近等电点的pH7.2时，形成的胶原纤维直径最大，而在pH 7.0以下不发生自组装。

离子强度对胶原蛋白自组装的影响也存在最适范围，狭鳕鱼皮胶原蛋白在30～60mmol/L最适合自组装，而罗非鱼的胃蛋白酶溶胶原蛋白在65～97.5mmol/L范围生长期增长斜率最大。

在不同的研究中，温度对自组装的影响不尽相同，大鼠鼠尾1型胶原在27°C、32°C和37°C表现为随着温度升高，静滞期依次缩短，27°C的静滞期最长[9]。而罗非鱼胃蛋白酶溶解型胶原蛋白则是28°C静滞期最短，28°C居中，37°C最长[3]。

浊度法的优点是简便易行，不足之处是无法获得胶原聚集体的数量和大小，而且产生浊度的干扰因素较多，容易产生较大误差[10]。

3.3 荧光光谱术

荧光光谱术是一种检测胶原自组装的有效方法，包括内源荧光和荧光探针，该方法快速、简便、准确，具有较高的灵敏度和选择性。现在用于胶原蛋白的荧光探针主要包括3甲氧基4’N,N二甲氨基黄酮（DMMF）、芘荧光探针和硫磺素T三种。

胶原蛋白中的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基等芳香族氨基酸具有固有荧光，对于Ⅰ型胶原蛋白，胶原蛋白分子中苯丙氨酸和酪氨酸残基之间的FRET变化可以揭示溶液中胶原蛋白分子相对位置的变化。Kun Wu等[11]将苯丙氨酸和酪氨酸残基之间的荧光共振能量转移（FRET）作为内源探针，与1,8-苯胺萘磺酸盐外源探针进行了比对研究。结果表明，利用荧光共振能量转移、荧光两相图和二维相关荧光光谱可以研究胶原在酸性溶液中的聚集。在0.30～0.45mg/mL范围内出现胶原蛋白聚集，而更复杂的胶原蛋白聚集在更高浓度的胶原蛋白（0.75和1.05mg/mL）下出现。通过对GdmCl诱导胶原蛋白进行的研究，这些聚集体通过脯氨酸的Ca或Cd原子与芳香族残基之间的CH-p相互作用来维持稳定，在二维相关荧光分析中出现298和316nm的峰[11]。刘炜熹等[2]将酪氨酸作为内源荧光，以280nm为激发波长，290～500nm为发射波长，对乌鳢胶原蛋白肽的组装过程进行检测，结果表明，随着离子强度的增加，胶原蛋白肽最大发射波长蓝移12nm，说明酪氨酸在自组装过程中逐渐被包裹遮蔽，导致最大荧光强度下降，可以通过荧光下降的程度来表征胶原蛋白自组装的进程[2]。贾俊强等[13]在用超声波对鲫鱼皮胶原蛋白处理的过程中，发现随着超声功率的增大，胶原蛋白内部的酪氨酸暴露出来，最大荧光强度的增强，进一步证实了内源荧光用于自组装过程检测的可行性[3]。

DMMF是一种分子内电荷转移化合物，对周围介质非常敏感，其荧光光谱可以根据周围的溶液环境而改变。因此，DMMF可以作为荧光探针来检测介质的极性和周围的微黏度，进而推断溶液中大分子构象的变化。胶原蛋白在380nm左右吸收接近于0。为了避免胶原蛋白自身发色团的干扰，Shi等[12]选择380nm作为DMMF的激发光。在0.1mol/L醋酸溶液中，当猪皮胶原蛋白浓度＞0.5mg/mL时，胶原蛋白链中的酰胺基团与酸性溶液中的氢离子结合明显增多，导致pH升高，分子内和分子间氢键作用增强，疏水的DMMF更易进入弱极性区域。所以，DMMF荧光在465nm处有明显升高，证明随着浓度增大，胶原蛋白发生明显的聚集。同样胶原蛋白浓度的情况下，随着pH的升高，DMMF荧光强度会进一步增强。

芘荧光探针是另一种研究胶原聚集行为的有力工具。在研究胶原蛋白聚集时，芘的激发波长为343nm，发射波长为360～500nm，将荧光探针I1/I3值稳定时胶原蛋白浓度0.48g/L作为狭鳕鱼皮胶原蛋白的临界聚集质量浓度[13]。

硫磺素T是苯并噻唑家族的一种荧光染料，可以特异性结合胃蛋白酶可溶性胶原蛋白，可用作研究胶原蛋白结构的敏感工具。荧光探针硫磺素T的激发波长为430nm，发射波长为450～600nm。在胶原蛋白自组装静滞期，荧光探针硫磺素T在485nm波长的荧光强度随着时间的延长而降低，因此更适合对胶原蛋白成核过程的监控。由于检测温度为30°C，避免了温度对硫磺素T荧光的影响[14]。

3.4 红外光谱

红外光谱可被用来分析红外辐射与分子振动模式之间的相互作用。分子吸收与其振动模式相对应的特征频率的红外辐射。胶原蛋白的酰胺键和侧链基团具有不同的振动频率，能够识别二级结构和分子相互作用，因此可用于探测胶原蛋白在自组装过程中二级结构的变化[15]。

胶原蛋白的傅里叶变换红外光谱中酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ带，与三螺旋密切相关结构。小牛皮肤胶原蛋白酰胺A 谱带的波数为3432cm-1，主要与N-H 伸缩振动有关。2979cm-1处的峰表示为与不对称伸缩振动相关的酰胺B带CH2。1640cm-1处的酰胺Ⅰ谱带主要与C=O相关沿着多肽主链的伸缩振动；1560cm-1处的酰胺Ⅱ谱带主要源自N-H弯曲振动与C-N拉伸相结合振动；1240cm-1处的酰胺Ⅲ谱带主要归因于C-H伸缩振动。此外，酰胺Ⅲ与1450带的吸收比也被认为可以评估胶原蛋白三螺旋结构的完整性。

小牛皮肤胶原蛋白样品与0～8mmol/L硅酸钠混合，自组装后均具有相似的特征峰，说明各浓度硅酸钠促进形成的原纤维均具有相似的二级结构，且AⅢ/A1450的比值均为1.0左右。说明所有自组装样品的三螺旋均是完整的[16]。

3.5 圆二色光谱术

在胶原蛋白中，酰胺发色团由肽键的羰基（C=O）和氨基（NH）形成。由于氮原子和氧原子的非键合电子之间的跃迁，这些酰胺发色团在UV区域表现出吸收。而手性分子与圆偏振光相互作用而导致左旋和右旋圆偏振光吸光度出现差异。胶原蛋白的三螺旋结构含有手性氨基酸，因此可以通过测量左旋和右旋偏振光的吸光度差异，了解胶原蛋白二级结构的信息。具有三螺旋结构的胶原蛋白在221～222nm出现正峰，在195～200nm出现负峰，且正峰与负峰的绝对值的比值越大，说明三螺旋结构越完整[17]。

Zhu Lulu等[18]对来自鳐鱼软骨的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白、来自鲟鱼软骨的胃蛋白酶可溶性胶原蛋白、鳐鱼软骨酸溶性胶原蛋白和鲟鱼软骨酸溶性胶原蛋白的研究表明，4种胶原蛋白的圆二色光谱均在221nm左右出现正峰，在200nm左右出现负峰，且Rpn分别为0.20、0.19、0.20、0.25，说明4种胶原蛋白均具有三螺旋构象。

圆二色光谱是非破坏性的，允许对同一样品进行重复测量，从而实现连续监测。同时，圆二色光谱可提供二级结构组成信息，但不能提供原子级细节。要深入了解更详细的结构，可以考虑使用其他技术，如X射线衍射、核磁共振波谱法等。

3.6 核磁共振波谱法

磁共振波谱分析原子核与外部磁场和射频辐射的相互作用。在胶原自组装的背景下，核磁共振波谱法检测特定核的化学位移、耦合常数和弛豫时间的变化。这些变化提供了有关构象变化、分子动力学和相互作用的信息，有助于深入了解胶原蛋白在自组装过程中的结构动态。

核磁共振波谱法也是一种非破坏性技术，可进行重复测量和进一步实验。因为不受芳香环的影响，这种方法可以成为表征胶原蛋白自组装的有效工具，可提供原子级分辨率并深入了解胶原蛋白的结构、动力学和相互作用。核磁共振波谱法通过化学位移变化识别酯化反应，并通过Pro-dH的高场位移量化三螺旋的形成由三螺旋形成引起的单个质子的屏蔽是胶原蛋白温度依赖性的可靠证明[19]。与13C相比，1H具有更高的旋磁比，更适合生物大分子的结构解析[20]。由于能够提供有关胶原蛋白构象变化、分子运动和结合相互作用的信息，使其处于组织工程、生物材料设计和再生医学研究的前沿。虽然在灵敏度和仪器方面存在挑战，但磁共振波谱仍然是揭示胶原蛋白自组装复杂细节、促进对组织力学的理解以及推动创新生物医学应用开发的基石技术。随着技术的不断发展，核磁共振波谱法将在阐明胶原蛋白自组装的复杂性方面发挥核心作用。

4.小结

总之，上述方法都能提供有关胶原蛋白自组装的独特信息：紫外-可见光谱可以监测分子环境和相互作用的总体变化；红外光谱可以提供有关胶原蛋白化学键和官能团的构成，有助于二级结构分析；圆二色光谱专注于胶原蛋白的手性结构，揭示二级结构成分（如α螺旋）的变化；磁共振波谱可以提供自组装过程中结构变化、构象动力学和分子相互作用的原子级信息。综合运用各种检测方法，有助于从不同维度加深对胶原蛋白自组装的理解，建立起胶原蛋白类医疗产品质量控制和评价有效方法。