体外诊断试剂干扰物质的研究探讨

周游 上海市医疗器械化妆品审评核查中心 （上海 200020）

内容提要： 对临床实验室检测的干扰会造成检测结果的不一致，从而对患者造成困惑和伤害。实验室通常无法轻易检测到由干扰引起的误差。为了避免这个问题，制造商应在产品设计阶段进行充分的干扰物质研究。常见的干扰包括血红蛋白、胆红素和脂质、类风湿因子、生物素等。文章对常见干扰物质的干扰机制进行总结，并结合审评经验，剖析干扰物质的研究关注点，供相关从业人员进行参考。

在体外诊断试剂的分析系统中，一个物质错误地引起示值的增加或减少而改变检测结果，这个物质被称为干扰物质。干扰物质可能会引起临床诊断及治疗的错误，对患者产生不利的结局。虽然临床实验室通过内部质量控制和外部质量评估程序可以对结果进行检查，但通常不容易检测到干扰引起的错误。因此，体外诊断试剂厂商应对干扰进行充分的重视和研究，提升分析系统的特异性。本文旨在讨论常见的干扰物质类型以及可能导致的体外分析干扰机制，结合相关审评经验，阐述干扰物质研究要点及常见问题，为研发与注册申报人员提供参考。

1.临床上常见的干扰物质及干扰机制

干扰分为内因干扰和外因干扰。内源性干扰来自患者自身样本中存在的物质，如溶血（血红蛋白等物质）、胆红素、脂类、蛋白质、抗体等。外源性干扰是指被引入患者样本的物质（如常用药物、其代谢物或药物制剂中的添加剂等）、患者摄入的物质（如酒精、营养添加剂等）、以及样本采集、运输、处理过程中引入的干扰，如溶血、防腐剂、抗凝剂等。还应该考虑到文献上已经报道过的干扰同类试剂或者测量程序的物质。申请人应当结合产品特点，筛选出可能干扰物质予以研究。

1.1 溶血

溶血历来被认为是影响生化结果的最常见的分析前错误。溶血是由红细胞膜的破坏引起的。红细胞脆性较大，对切向应力敏感。据研究表明，在特定人群，如糖尿病、多发性硬化症和绝经后女性中，红细胞的机械脆性增加[1]。两种主要的溶血类型包括体内溶血和体外溶血。体内溶血可能由于手术或药物原因导致，体外溶血多由物理因素（机械性破坏、冷冻）引起。在体外溶血中，由于不当操作，如针头过小导致红细胞通过针尖时被破坏、抗凝时用试管摇晃太剧烈、标本存放温度不合适或在运输过程中处理不当导致红细胞被破坏。

溶血可能通过多种机制干扰生物化学结果。主要分为改变样品中分析物浓度和干扰分析物测量两种途径。①由于许多物质在红细胞内外存在较大浓度差，因此红细胞内内容物的释放会改变测定结果。一些红细胞内本身包含的高浓度物质，如血红蛋白、镁、天冬氨酸转氨酶等物质会使测值升高，而红细胞内浓度较低的物质，检测结果会由于细胞内液的稀释作用而错误降低。②氧合和脱氧血红蛋白的吸光度光谱略有不同，但在415nm附近显示最大吸光度，在320～450nm和540～580nm有较为显著吸光度[2]。因此，在这些范围内使用基于吸光度测量的比色测定法更容易受到干扰。③溶血也可能引起与分析反应的酶的释放。例如，腺苷酸环化酶对肌酸激酶测定产生干扰[3]。除此之外，溶血引起的负干扰和正干扰相互作用也可能形成综合干扰。

1.2 胆红素

胆红素存在于人类胆汁中的主要色素，呈棕黄色。胆红素在生物体内起着重要的生理作用，并且与多种生物过程密切相关。一般胆红素的升高多由肝脏疾病引起。胆红素吸收的光在400～540nm，峰值在460nm左右，在这些波长处进行初级或次级吸光度测量的比色测定可能会受到一定影响[4]。胆红素的抗氧化特性使其能够与过氧化氢反应，这是黄疸干扰的另一种机制。过氧化氢是一些常见化学检测（包括胆固醇、甘油三酯、尿酸和酶促肌酐）的中间产物，因此容易受到黄疸干扰[5,6]。

1.3 高血脂症

高脂血症是一种病理状态，其特征是患者血浆中至少有一种脂质成分高于正常范围，这通常是由于患者的脂肪转运或代谢功能出现异常所引发的。在这种情况下，乳糜血的出现频率增加，其表现形式为血浆呈乳白色或浑浊，血液中的脂肪含量显著增加。

乳糜颗粒是乳糜血中的主要成分，主要由脂蛋白、胆固醇和三酰甘油构成。这些颗粒的存在会对血液检测产生一定的干扰作用，主要包括以下几个方面：首先，乳糜颗粒会导致光散射，从而产生测量误差；其次，乳糜颗粒的存在会占据一定的体积，体积减少导致水相减少；最后，脂肪颗粒会大量吸附在红血球上，不仅使溶血速度降低，而且对红血球的实际数量下降、白血球增多等红血球的检查结果也会产生影响[7]。

1.4 类风湿因子

类风湿因子（Rheumatoid Factor，RF）是一种在临床上常见的自身抗体，是内源性人抗体结合人γ球蛋白。RFs表现出对聚集的γ球蛋白的优先结合，并参与免疫复合物的清除机制。然而，类风湿因子在检测过程中可能对一些检查系统产生干扰，造成检测结果的不正确。

RF主要是针对IGG Fc区的天然抗体。在标准的双位点夹心免疫分析中，RF的干扰可能是正向或负向的。当RF与捕获抗体结合时，会形成空间位阻，可能导致错误的抑制结果。当RF结合检测抗体时可能会导致错误的升高结果。因此，在进行类风湿因子检测时，需要考虑到这种干扰因素，并采取相应的措施来消除或减小这种干扰，以确保检测结果的准确性[8]。

1.5 生物素

生物素与链亲和素之间的相互作用是生物体内蛋白质与配体之间最强烈的非共价结合之一，这种结合具有快速形成、耐受极端温度、pH值和变性剂的特性。其键结形成迅速，耐极端温度、pH值和变性剂。因此，生物素-链霉亲和素偶联是体外诊断测试的常见组成部分，有助于检测和靶向生物分析物。然而，血液中高生物素含量会导致检测结果的不准确。饮食生物素摄入通常不会导致血液生物素浓度超过体外诊断试验的干扰阈值。然而，最近大剂量生物素补充剂的趋势出现了对免疫测定的干扰现象。所有基于生物素的免疫分析都容易受到生物素的干扰。根据生物素剂量、试验设计和试验干扰阈值的不同，生物素干扰可能导致假低（夹心免疫测定）或假高（竞争性免疫测定）结果[9,10]。

2.干扰物质的研究关注点

以审评经验来看，申报资料干扰试验大多缺乏科学性。常见的问题有：试验条件无法覆盖说明书声称内容，分析物浓度未包含医学决定水平或参考区间上/下限附近、干扰物浓度选择不合理或添加方式不合理等。

有关干扰试验的试验方案设计有：中华人民共和国医药行业标准WST 416-2013《干扰实验指南》、CLSI发布的《EP7-A2:Interferencetestinginclinicalchemistry;approved guideline-secondedition》《定量检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》等。可采用添加干扰物质的样本进行研究方法，或者通过申报试剂和不受该干扰物影响的测量程序检验结果间的比对有代表性的患者样本，进行干扰物质研究。

2.1 添加干扰物质的研究

干扰试验一般可采用配对比对的方式，即采用添加干扰物质的样本进行研究（添加的干扰物体积应不影响反应体系的整体基质），比较干扰样本和不包含或含正常浓度水平干扰物样本检测结果间差异。如果差异超出接受范围，再进一步研究该干扰物质的浓度水平。

在干扰物的筛选过程中，需要根据产品的具体特性进行深入的分析和选择。包括：在病理条件下产生的代谢物，在患者治疗过程中引入的化合物（如药物、血浆扩张剂和抗凝血剂）、患者摄入的物质，在标本制备过程中添加的物质等。在进行试验之前，必须确保试验的客观性。研究人员需要根据分析物的医疗用途来设定干扰物的总允许误差，以此来判断一定浓度的干扰物是否可以被接受。这个总允许误差可以参考我国国家卫生健康委临床检验中心临床检验室间质量评价计划中的相关规定，或者根据临床专家的实践经验，经过广泛的讨论，制定相关的标准。此外，也可以根据生物学变异或分析变异来确定总允许误差。

在分析物试验浓度的选择上，建议使用至少两个分析物水平的样本，这些浓度应在医学决定水平或参考区间的上下限附近。当需要明确干扰物质浓度与干扰程度之间的关系时，往往需要纳入更多分析物浓度的样本。对于干扰物试验浓度来说，常见可能内源性干扰物的建议试验浓度可参考《干扰实验指南》附录C或CLSI-EP7-A2文件附录D（appendixD.InterferenceTestConcentrationsforEndogenous Analytes）。内源性干扰物一般为目标人群中预期的最高浓度。在确定检测次数的过程中，需要综合考虑多个因素，包括被评估方法的批内重复性标准差、试验浓度下的干扰标准以及置信水平等。通过运用统计学方法进行计算，以最终确定合适的检测次数。

在数据处理与分析中，可通过试验样本与对照样本的偏差标识干扰结果dobs，然后根据无效假设值（dnull，通常为0）、对双边检验100(1-α)%置信水平时正态分布的百分数（z(1-α/2)）、被评价方法的批内重复性标准差s以及样本重复次数n来计算界值dc。见公式（1）～（3）。

其中：t0.975,n-1是自由度为n-1,t分布97.5%的概率密度值。

根据计算结果，如果dobs≤dc，那么可以认为在当前浓度下，该物质并未对评价产生明显的干扰作用。然而，如果dobs＞dc，那么就应当认为在当前浓度下，该物质存在显著的干扰影响。

2.2 使用患者标本评估干扰

在试验设计中，还可以基于两组患者标本（检测组和对照组）进行分析，这两组标本应分别使用被评估的检测方法、参考检测方法或其他合格的对比检测方法进行比较。在此过程中，已知对干扰敏感度较低的参考检测方法被用来在对比研究中建立“真值”。为了保证试验的可靠性，检测标本应来源于具有特定疾病、服用特定药物或其他已知组成成分的目的患者群体。而对照组样本则应来自无相关疾病、未服用相关药剂的人群，且其待分析物的分布应与检测标本基本一致。

在数据分析阶段，应主要判断对比检测方法中由干扰引起的差异是否显著，以及干扰形成偏差的方向。然而，需要注意的是，利用患者标本评估干扰的方法仅能建立干扰与偏差之间的关联关系，而不能确定干扰物的具体来源。真实的干扰物可能是恰巧与疑似干扰物同时存在的物质。比如，由于疾病产生的生化代谢物引起的干扰可能会被错误地归结为用于治疗疾病的药物。

3.小结与展望

随着新疗法的发展，新的干扰物质也不断出现。随着越来越多的检测方法被开发出来，更多的物质也可以被检测。在降低试剂的干扰方面，医疗器械厂商需要深入和专业的调查，可在检测设计、抗体的结构和特异性以及信号产生和检测方面进行改进，以提升试剂的抗干扰性能。