γδT淋巴细胞及其亚型在毒性弥漫性甲状腺肿中的分布研究

王姜琳,梁冬雨,汪国庆,赵江峰,汤明明,杨慧健

1.上海市嘉定区中心医院检验科,上海 201800;2.上海市嘉定区中心医院中心实验室,上海 201800;3.上海市嘉定区中心医院风湿免疫实验室,上海 201800;4.上海市嘉定区中心医院内分泌科,上海 201800;5.上海中冶医院检验科,上海 200941

毒性弥漫性甲状腺肿(GD)是一种器官特异性自身免疫性疾病。临床上85%的甲状腺功能亢进均由GD引起[1],患者血清中常存在多种自身抗体,特别是针对促甲状腺激素(TSH)受体的抗促甲状腺激素受体抗体(TRAb)。随着医学科学技术的发展,甲状腺疾病的研究和临床治疗技术取得了进展。但GD与其他自身免疫性疾病一致,存在普遍疗效不佳、尚无有效治疗手段的局限,其根本原因在于GD的发病机制尚不清楚。有研究表明GD的发病机制可能与环境、表观遗传及免疫学机制等因素有关[2]。人类γδT淋巴细胞作为T淋巴细胞中的一个特殊群体,主要有Vδ1γδT淋巴细胞和Vδ2γδT淋巴细胞2个亚群。LIU等[3]的研究证实桥本甲状腺炎(HT)中γδT淋巴细胞活化能够辅助B淋巴细胞产生抗体,而GD类似于HT也是一种以自身体液免疫反应为主要特点的自身免疫性甲状腺疾病,可能与HT存在着相似的免疫学发病机制。本文通过研究γδT淋巴细胞及其不同亚型在GD中的分布情况,分析GD中γδT淋巴细胞表面活化标志物与协同刺激分子的表达水平,探讨γδT淋巴细胞在GD免疫学发病机制中可能的作用,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2022年6-12月上海市嘉定区中心医院(以下简称本院)内分泌门诊确诊的GD患者59例作为GD组,其中男16例,女43例,平均年龄为(40.31±11.34)岁;另选择同期65例健康志愿者作为对照组,其中男21例,女44例,平均年龄为(40.72±12.80)岁。两组年龄、性别等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。GD的诊断标准参考《中国甲状腺疾病诊治指南:甲状腺疾病的实验室及辅助检查》[4],(1)临床表现:①甲状腺功能亢进症状或体质量减轻、心动过速、出汗等;②甲状腺弥漫性肿大;③眼球突出或其他浸润性眼征。(2)实验室检查结果:①甲状腺激素水平升高;②TSH水平降低;③TRAb或甲状腺刺激抗体(TSAb)阳性;④甲状腺对放射性碘(或99TcmO4-)摄取能力提高。以上诊断标准中,符合以下3种情况可作为GD纳入标准:(1)至少具有1项临床表现和4项实验室检查结果均异常;(2)至少具有1项临床表现和实验室检查中3项结果异常;(3)至少具有1项临床表现和实验室检查中1～2项结果异常,且血清中游离甲状腺素(FT4)水平升高维持至少3个月以上。排除标准:(1)有其他器质性疾病或自身免疫性疾病;(2)正在使用免疫抑制剂。所有研究对象均知情同意本研究并签署知情同意书,本研究经本院医学伦理委员会审核批准通过(批准文号:2019K06)。

1.2仪器与试剂 别藻蓝蛋白(APC)抗人CD3、藻红蛋白(PE)抗人T淋巴细胞表位γδT(TCR γδT)、PE抗人TCR Vδ1γδT、PE抗人TCR Vδ2γδT、异硫氰酸荧光素(FITC)抗人CD69、FITC抗人HLA-DR、FITC抗人CD40配体(CD40L)、FITC抗人诱导性共刺激分子(ICOS)抗体等流式抗体均购自美国BD公司,磷酸盐缓冲液(PBS)及ficoll淋巴细胞分离液等购自上海生物工程有限公司。所用流式细胞仪为FACSCantoⅡ(美国BD公司),全自动化学发光免疫分析仪(MAGLUMI X8购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司,雅培a3600免疫流水线购自雅培医疗用品(上海)有限公司,游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体 (TG-Ab)、TRAb、FT4、TSH检测试剂均来自雅培医疗用品(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1检测两组甲状腺相关指标 取红管促凝血3 mL,离心分离血清,采用化学发光法分别检测甲状腺相关指标,包括FT3、FT4、TSH、TPOAb、TG-Ab、TRAb。

1.3.2分离外周血单个核细胞(PBMC) 取肝素抗凝新鲜静脉血4 mL,用PBS(1∶1)稀释后,沿管壁缓慢加入至含有等体积ficoll淋巴细胞分离液的试管中,2 500 r/min离心20 min;吸取试管中间白色界面层至另一试管中,加入5 mL PBS清洗1次,1 500 r/min离心5 min后弃上清液,再重复清洗1次。轻轻倒去上清液后将细胞沉淀轻轻弹匀,得到所需细胞。

1.3.3流式细胞术检测 γδT淋巴细胞及其亚型的比例 取2×105个PBMC于试管内,重悬于100 μL PBS中,分别加入相应荧光标记的单克隆抗体APC-抗人CD3,PE-抗人TCR γδT、PE-抗人TCR Vδ1γδT、PE-抗人TCR Vδ2γδT,充分混匀,室温下避光静置20 min。PBS 2 mL洗涤2次,每次1 500 r/min离心10 min,将细胞重悬于400 μL含有4%多聚甲醛的PBS中,置于4 ℃环境下避光保存待测。

1.3.4流式细胞术检测γδT淋巴细胞表面活化分子D69、HLA-DR和协同刺激分子CD40L及ICOS的表达水平 取2×105个PBMC于试管内,重悬于100 μL PBS中,加入APC-抗人CD3,PE-抗人TCR γδT, FITC-抗人CD69、抗人HLA-DR、抗人CD40L及抗人ICOS等抗体,室温下避光静置20 min,PBS 1 mL洗涤2次后,每次1 500 r/min离心10 min,将细胞重悬于400 μL含4%多聚甲醛的PBS中,置于4 ℃环境下避光保存待检。

2 结 果

2.1两组血清甲状腺相关指标比较 GD组TSH水平低于对照组,FT3、FT4、TPOAb、TG-Ab、TRAb水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清甲状腺相关指标比较

2.2两组外周血中γδT淋巴细胞及其亚型比例比较 两组γδT淋巴细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05)。GD组Vδ1γδT淋巴细胞比例高于对照组,Vδ2γδT淋巴细胞比例低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组外周血中γδT淋巴细胞及其亚型比例比较

2.3两组γδT淋巴细胞表面活化分子及协同刺激分子的表达水平比较 GD组γδT淋巴细胞表面活化分子CD69、HLA-DR表达水平及协同刺激分子CD40L、ICOS的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组γδT淋巴细胞表面活化分子及协同刺激分子的表达水平比较

3 讨 论

GD是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病。好发于30～60岁的人群,多见于女性,男、女发病比例为1∶8,发病率分别为0.5%、3.0%[5-6]。典型临床表现包括高代谢症候群、甲状腺肿大和眼病3个方面。GD同许多其他自身免疫性疾病一样,缺乏有效治愈手段,经抗甲状腺药物治疗后复发率高达30%～50%[7],其根本原因在于目前对GD的认识不足,且治疗措施主要为对症治疗。有研究结果显示GD的发病机制非常复杂,涉及免疫、遗传、环境、性别等诸多因素,其中免疫功能紊乱对其发生、发展起着核心作用[8],该疾病的特征是机体产生了病理性的自身抗体TRAb和TPOAb,本研究中GD组TPOAb、TG-Ab、TRAb水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),与GD的特征相符。而GD中高滴度的抗体提示机体中具有能够辅助B淋巴细胞产生抗体的辅助性T淋巴细胞存在。

在B淋巴细胞功能活化并产生抗体的过程中,辅助性T淋巴细胞发挥着至关重要的作用[9]:(1)活化的T淋巴细胞通过抗原递呈、上调细胞表面分子等途径增强T/B淋巴细胞间的相互作用,促使B淋巴细胞活化并进一步分化为浆细胞且产生抗体;(2)活化的辅助性T淋巴细胞可分泌多种细胞因子参与抗体的类别转换,从而调节体液免疫应答。B淋巴细胞活化并产生抗体的过程中,ICOS及其配体(ICOSL)、CD40及CD40L、淋巴细胞功能相关抗原和细胞间黏附分子等分子共同形成辅助性T淋巴细胞与B淋巴细胞间的免疫突触,参与T/B淋巴细胞间的相互作用,并介导T淋巴细胞传导B淋巴细胞活化信号[10]。

人类T淋巴细胞是一个复杂的细胞群体,根据其表面受体TCR的不同,可以将T淋巴细胞分为αβT淋巴细胞与γδT淋巴细胞2类。人类γδT淋巴细胞表面受体TCR由γ和δ 2条肽链组成,根据γδ链表达不同分为Vδ1γδT、Vδ2γδT与Vδ3γδT淋巴细胞3个主要的细胞亚群,其中Vδ1γδT、Vδ2γδT这2个亚群占γδT淋巴细胞的90%以上。γδT淋巴细胞相似于αβT淋巴细胞,又有别于αβT淋巴细胞,αβT淋巴细胞主要参与特异性免疫应答,而γδT淋巴细胞兼具特异性和非特异性免疫应答双重特征。γδT淋巴细胞多分布在上皮和黏膜等处,在抗感染免疫和肿瘤免疫中发挥着重要作用[11-12], γδT淋巴细胞在自身免疫性疾病中如何发挥作用目前尚不很清楚,但有研究表明γδT淋巴细胞与自身免疫性疾病的发病过程密切相关[13], 文献[14]中报道在类风湿关节炎(RA)的滑膜、硬皮病的皮肤,以及系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、成人Still病、过敏性紫癜及白血病的外周血中γδT淋巴细胞数目及亚群均存在改变。在健康人外周血T淋巴细胞中,γδT淋巴细胞所占比例甚少,仅为1%～5%。Vδ1γδT、Vδ2γδT淋巴细胞2个亚群作为γδT淋巴细胞2个主要细胞亚群,具有各自的分布特点,Vδ1γδT淋巴细胞主要分布于皮肤、小肠黏膜和器官等组织,血液中有少量分布;Vδ2γδT淋巴细胞主要分布于血液中,胸腺和黏膜上皮组织中也有少量分布。刘红利等[15]研究发现HT患者甲状腺组织中γδT、Vδ1γδT淋巴细胞比例较单纯甲状腺肿患者甲状腺组织中γδT、Vδ1γδT淋巴细胞比例明显上调,两组间Vδ2γδT淋巴细胞比例无明显差异,并且HT患者甲状腺组织中以Vδ1γδT淋巴细胞为主,符合上述Vδ1γδT淋巴细胞的分布特点;此外其研究也提示HT患者外周血γδT淋巴细胞比例略高于健康对照组,但无明显差异,HT患者外周血Vδ1γδT淋巴细胞比例明显高于健康对照组,而Vδ2γδT淋巴细胞比例略低于健康对照组,无明显差异,其具体原因尚未阐明。本研究中两组γδT淋巴细胞比例比较,差异无统计学意义(P>0.05)。GD组Vδ1γδT淋巴细胞比例高于对照组,Vδ2γδT淋巴细胞比例低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。此研究结果与刘红利等[15]的研究一致,可能因为GD类似于HT也是一种以自身体液免疫反应为主要特点的自身免疫性甲状腺疾病。

一些学者认为,γδT淋巴细胞可作为抗原递呈细胞,并且可与其他细胞相互作用调节免疫反应。同时,γδT淋巴细胞分泌的细胞因子又可以通过增强或抑制免疫球蛋白产生及非特异性的杀伤功能等进一步影响这些疾病的病理进程[16-17]。RA炎症关节的滑液中的γδT 淋巴细胞以表达Vδ2γδT的亚群为主,同时表达CD69、CD45RO等活化标志物;用异戊烯焦磷酸刺激培养后能够上调表达抗原递呈细胞样特定细胞分子HLA-DR、CD80/86水平,并且将一些可溶性抗原和合成肽呈递给CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞,从而导致CD4+T淋巴细胞持续活化,与RA的发生、发展密切相关[18-20]。综合这些研究成果,表明γδT淋巴 细胞参与了自身免疫性疾病的发生、发展过程,在其过程中具有抗原提呈、免疫调节、辅助T淋巴细胞的功能。另有研究发现在HT中,活化的γδT淋巴细胞通过表达协同刺激分子(CD40L、ICOS)能够辅助B淋巴细胞产生抗体[3],GD也作为一种以自身体液免疫反应为特点的自身免疫性疾病,它很可能同HT存在着相同或相似的发病机制。 本研究结果显示,GD组γδT淋巴细胞表面活化分子CD69、HLA-DR表达水平及协同刺激分子CD40L、ICOS的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述,γδT淋巴细胞功能活化及其表达协同刺激分子(CD40L、ICOS)可能是促进GD产生自身抗体并诱导自身体液免疫应答重要病理机制之一,但具体作用则有待于进一步研究。