心肌肌钙蛋白I检测结果假阴性病例报道并文献复习

刘路遥,袁文涛,江 波,任书文,何成山

上海中医药大学附属第七人民医院医学检验科,上海 200137

心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌损伤时可迅速释放至外周循环中,cTnI因其心脏特异性好,灵敏度高,检测窗口期长,已成为临床上诊断心肌损伤的首选血清学标志物[1]。cTnI的临床检测基于夹心抗体免疫法,检测/捕获抗体与cTnI不同抗原表位相结合,通过检测抗体上酶标基团的化学发光信号,计算cTnI水平[2]。近年来随着免疫检测和单克隆抗体技术的提升,溶血、黄疸、脂血、抗凝剂等分析前因素的影响已变得微乎其微[3],相对而言一些内源性自身抗体对免疫学检测的干扰作用更加令人关注[4-5]。本研究报道了1例因免疫性心肌肌钙蛋白I自身抗体(cTnIAAb)导致cTnI与其他心肌损伤标志物检测结果严重不相符的临床案例,现报道如下。

1 病例资料

1.1一般资料 患者,女,76岁,主诉右下肢隐痛3 d,加重1 d。入院查体:右下肢膝关节以下皮肤青紫,活动受限。辅助检查:(1)右下肢血管超声。右侧股总动脉、股深动脉、股浅动脉、腘动脉栓塞,右侧下肢深静脉血流通畅。(2)CT检查。主动脉粥样硬化,心脏增大,心包少量积液,下侧双肢动脉粥样硬化,右侧股动脉和腘动脉节段性闭塞。(3)心电图检查。心房颤动,左室高电压,T波V4、V5、V6倒置,Q-T间期延长。(4)心脏超声检查。全心扩大,室间隔增厚,二尖瓣,主动脉瓣轻度反流。(5)实验室检查。cTnI 0.023 ng/mL(正常参考值<0.026 ng/mL),肌酸激酶同工酶(CM-MB)113 ng/mL(正常参考值<5 ng/mL),肌红蛋白(MYO)648 ng/mL(正常参考值0～106 ng/mL),B型钠尿肽(BNP)282 pg/mL(正常参考值10～100 pg/mL),乳酸脱氢酶(LDH)273 U/L(正常参考值125～220 U/L),肌酸激酶(CK)1 241 U/L(正常参考值50～310 U/L)。入院诊断:右下肢动脉栓塞,主动脉及双下肢动脉硬化,心房颤动,高血压。

1.2病例分析 患者年龄较大,全身性疾病较多,心电图显示心律失常,心房纤颤,形成的血栓经血液循环造成下肢动脉急性栓塞。心脏超声检查显示全心增大,室间隔增厚,BNP水平大幅度升高,提示患者出现较为严重的心力衰竭表现。左室高电压,T波V4、V5、V6倒置,提示心肌出现缺血性改变。心肌损伤标志物CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,但cTnI为0.023 ng/mL(正常参考值<0.026 ng/mL)提示检测结果正常。患者心律失常,心功能较差导致代偿性全心增大,心肌长期缺血,产生心肌损伤,造成心肌损伤的血清学标志物水平显著升高,而cTnI的检测结果却未见明显异常。对这一异常现象进行分析,笔者猜想cTnI检测结果出现了假阴性。

1.3cTnI检测异常结果的分析

1.3.1cTnI检验结果复检 自检Abbott Architect i2000全自动免疫分析仪状态和室内质控,确认无误后对该样本进行复测,复测结果cTnI为0.025 ng/mL,与原结果基本一致。为了验证是否为检测系统的因素,笔者另使用Roche Cobas e602和Sunlant SLP-001检测系统及相关配套试剂对样本的cTnI水平进行复测,检测结果均显示为阴性。鉴于3种不同cTnI检测系统对于此患者血清样本的cTnI检测结果均为阴性,笔者考虑是否为一种内源性自身抗体干扰了cTnI的免疫学检测,造成cTnI的检测结果异常。

1.3.2检测抗核抗体谱免疫球蛋白G(IgG)水平 采用Sunlant公司抗核抗体谱IgG检测试剂盒,检测该血清样本的抗核抗体,结果显示:Ro-52、SS-A/Ro、PO、线粒体抗体(M2)、组蛋白、双链DNA(dsDNA)、Jo-1、核小体、nRNP/Sm、Sm、PM-Scl、类风湿因子(RF)为阴性,SSB(30.68 RU/mL)、Scl-70(34.53 RU/mL)、CENPB(451.29 RU/mL)呈弱阳性(以上各项参考值≤20.00 RU/mL),提示该患者可能存在系统性红斑狼疮、弥漫性系统性硬化等一系列自身免疫性疾病,但病程记录中未见。基于患者存在自身免疫性疾病,外周循环中含有多种自身免疫性抗体,证实了笔者的猜想,可能是某种内源性的自身抗体干扰了cTnI的检测造成假阴性结果,最有可能的为cTnIAAb。

1.3.3采用前期自建的一种基于蛋白芯片的cTnIAAb检测方法,以天然cTnI-肌钙蛋白C(TnC)和TnC为抗原,辣根过氧化物酶-鼠抗人IgG作为二抗[6],检测该样本血清cTnIAAb。结果显示cTnI-TnC列光圈明亮饱满,检测信号值达8 004.1 AU/mL,而TnC列仅为405.3 AU/mL,提示该患者血清样本cTnIAAb强阳性,见图1。

注：第1～3列点样顺序:鼠源性1-IRP抗体、cTnI-TnC、TnC。

1.3.4cTnIAAb对cTnI检测的影响 为了明确该患者血清样本中的cTnIAAb对cTnI检测的负性干扰程度,笔者在cTnIAAb阳性和阴性基质血清样本(cTnI和cTnIAAb均为阴性)中加入一定体积终水平为200 ng/mL cTnI-TnC的天然抗原,置于37 ℃水浴箱孵育30 min后经Architect i2000全自动免疫分析仪上机测定,cTnI测定值分为cTnI回收浓度和理论浓度,并计算cTnI回收率,cTnI回收率=(cTnI回收浓度-基础cTnI值)/cTnI理论浓度(因样本基础cTnI<0.026 ng/mL可忽略不计)。结果显示加入0.25 μL、0.50 μL、1.00 μL、1.50 μL、2.00 μL、2.50 μL 200 ng/mL的cTnI-TnC天然抗原后,cTnIAAb阳性样本中cTnI回收率分别为19.37%、25.36%、32.18%、40.78%、53.28%、68.15%,cTnI回收率随着加入cTnI-TnC抗原量的增多而升高,呈正相关,具有良好的线性关系(R2=0.98,P=0.001),见图2。

注：cTnIAAb阳性患者血清的cTnI回收率,Y=20.73×X+13.03,R2=0.98。

2 文献复习

以“cTnI免疫学检测干扰”和“cTnIAAb”为关键词对知网和SCI数据库从1995年至2023年发表的文献进行检索。共检索到文献35篇,排除15篇,最终保留文献20篇。结合病历分析和文献复习,本文主要从临床上干扰cTnI免疫检测的角度出发,重点叙述cTnIAAb的研究进展,总结cTnIAAb干扰cTnI免疫检测的成因和机制等研究现状。

2.1cTnIAAb的研究进展 外周循环中的cTnI抗原会促进机体的自身免疫系统产生特异性的cTnIAAb[7]。1996年BOHNER等[8]首次在1例接受冠状动脉旁路手术的患者体内发现了一种可与cTnI结合的IgG,造成该患者cTnI检测结果正常而其他心肌损伤血清标志物水平大幅度上升,后续ERIKSSON等[9]研究证实了该IgG为造成cTnI检测结果异常的主要原因,并首次提出了cTnIAAb的概念。cTnIAAb广泛存在于缺血性心肌病、扩张性心肌病等心肌类疾病中[10-11],cTnIAAb与心肌损伤后的持续性炎症反应、心脏功能受损、心室重构和心力衰竭等密切相关[12-14]。

2.2cTnIAAb干扰cTnI免疫检测机制 在cTnI的免疫学检测中,肽链的N端(a.a.r 1-30)和C端(a.a.r 30-110)抗原氨基酸残基易被蛋白酶水解,中心稳定区域(a.a.r 30-110)的氨基酸受TnC的保护[15],由于其化学性质较为稳定被广泛作为特异性cTnI检测抗体位点,在后续的研究中发现即使针对中心稳定区域设计的特异性检测抗体依然会受到多种因素的干扰,其中最主要的就是cTnIAAb[16-17]。cTnIAAb可被特异性的cTnI捕获或检测抗体竞争结合循环中的cTnI抗原,造成cTnI检测结果失真[18]。有研究显示,cTnIAAb与cTnI肽链的a.a.r 65-74、83-93、86-90、104-119、117-126和130-145抗原表位相结合[16],这些抗原表位主要位于cTnI肽链的中心稳定区域并向羧基端延伸,其中受cTnIAAb严重影响的中心稳定区域与大部分商业化cTnI试剂盒的捕获/检测抗体结合位点相似,这也证实了大部分cTnI检测试剂都无法摆脱cTnIAAb干扰的原因。

3 讨 论

本研究中患者心功能不全,全心代偿性增大伴严重心力衰竭,心肌存在长期缺血性损伤,cTnI持续释放至外周循环中。基于患者存在自身免疫性疾病史,长期微量的cTnI抗原会促进机体的自身免疫系统产生cTnIAAb。血清cTnI检测结果为阴性,其他心肌损伤标志物如:CK、CM-MB、MYO水平均大幅度升高,结合临床资料笔者猜想cTnI异常检测结果可能是cTnIAAb造成的。笔者首先使用原检测系统对样本cTnI进行了复检,又采用了Roche和Sanlant两种不同cTnI检测系统进行cTnI复测,结果均为阴性。不同cTnI检测系统中针对cTnI抗原设计的特异性抗体的抗原表位存在一定的差异,基于国际临床化学联合会公布的全球知名的cTnI检测系统特异性抗体抗原表位(检测/捕获抗体)[19],其中Abbott Architect cTnI(a.a.r 24-41,a.a.r 86-91,a.a.r 42-49);Roche cobas e601/602 cTnI(a.a.r 86-91,a.a.r 22-44),笔者猜想可能是由于样本中的cTnIAAb封闭cTnI上述区段的抗原表位,使得检测/捕获抗体无法结合cTnI,造成cTnI检测结果呈假阴性。

血液中的cTnI存在形式复杂,单体cTnI易被蛋白酶水解,大部分以cTnI-TnC复合物的形式存在[20]。因此笔者模拟cTnI在外周循环中的主要存在形式,采用cTnI-TnC天然抗原点样芯片,自建了一种全新的cTnIAAb检测方法[1],结果显示该患者血清cTnIAAb为强阳性,证实了笔者的猜想。为进一步研究cTnIAAb对cTnI检测系统的负性干扰程度,笔者将cTnI-TnC抗原加入cTnIAAb阳性患者血清和cTnIAAb阴性介质血清中,进行cTnI回收实验,结果显示cTnIAAb阳性血清中加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原后,cTnI回收率为19.37%,即使加入2.5 μL的200 ng/mL cTnI-TnC天然抗原时,cTnI回收率也仅为68.15%。cTnI回收率随着加入cTnI-TnC天然抗原量的增多而增加,呈正相关,具有良好的线性关系(R2=0.98,P=0.001),研究结果证实该样本血清中的cTnIAAb可严重干扰Architect i2000对cTnI的检测,导致cTnI检测结果出现假阴性,产生cTnI结果与其他心肌损伤标志物严重不相符的现象。

综上所述,cTnIAAb可与cTnI特异性抗体竞争性结合cTnI抗原表位,从而导致cTnI检测结果严重失真,产生cTnI结果与心肌损伤标志物严重不符的现象。以上提示在临床工作中遇到此类现象时,应当首先自检当日质控及仪器状态以保证检验结果的准确性,积极与临床医生沟通了解患者的临床表征与cTnI检测结果是否相符,共同寻找cTnI检测结果异常的原因。