血清circRNA、Notch-3联合胃蛋白酶对胃癌的诊断价值及与分期的相关性

郭 超,杜 园,张慧芳,王 辉,马 迪,王 岚,杨金宝

河北省涿州市医院:1.普外科;2.内镜中心;3.妇科;4.营养科;5.产科,河北保定 072570

胃癌现已成为全球范围内因癌症死亡的第3大癌,对人类生命及身体健康产生极大威胁,我国胃癌发病率及病死率占全球的45%[1-2]。早期胃癌发病较为隐匿,且进展较缓,不易被发现,容易出现漏诊、误诊现象,当患者出现胃癌相关体征时,通常已发展为中晚期,治疗效果及预后较差,不利于患者后续恢复,因此早发现、早治疗是延长患者生存周期的关键[3-4]。现阶段国内鉴别胃癌常用胃镜检查及病理诊断,这些方法具有较强的可行性,但也存在较大的局限性,胃镜检查较复杂,患者需承担一定的痛苦及风险,且胃镜检查对设备的依赖度较高,患者的配合度较差,对于大规模的胃癌筛查及早期诊断并不适用[5-6]。部分发达国家开始尝试采用肿瘤血清学指标进行胃癌筛查,该方法具有无创、操作简单等优势,现如今胃癌相关的DNA、RNA及蛋白质等肿瘤标志物对胃癌筛查具有重要意义[7-8]。胃癌患者中血清环状RNA(circRNA)是一类共价闭合环状RNA,具有较强的组织表达特异性,可作为肿瘤检测及诊断的分子标志物;神经源位点缺口同源蛋白3(Notch-3)是一种高度保守的跨膜蛋白质,它与肿瘤诱导细胞的合成及调控具有一定联系,从而进一步影响肿瘤细胞的生长;胃蛋白酶可以反映胃黏膜萎缩程度,在胃癌发生及发展过程中具有重要意义[9]。但我国关于circRNA、Notch-3及胃蛋白酶对胃癌诊断价值的研究较少,基于此,本研究对circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平进行观察,分析三者单独及联合检测在胃癌诊断中的价值及其与胃癌分期的相关性。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年3月至2023年3月本院收治的150例胃癌患者和150例胃部良性病变患者分为研究组和良性组。研究组男62例,女88例;年龄42～65岁,平均(53.16±5.44)岁;体质量指数(BMI)21.16～25.58 kg/m2,平均(22.52±1.08) kg/m2;农村57例,城市93例;文化程度:大专及以上89例,高中及以下61例。良性组男63例,女87例;年龄41～66岁,平均(53.76±5.17)岁;BMI 21.22～25.69 kg/m2,平均(22.41±1.02)kg/m2;农村59例,城市91例;文化程度:大专及以上90例,高中及以下60例。两组年龄、性别、BMI等基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有研究对象均知情同意。本研究已获得本院医学伦理委员会审批通过(HK20201125)并且符合《赫尔辛基宣言》的操作规范与标准。研究组依据美国癌症联合委员会(AJCC)第7版胃癌分期指南[10]分为Ⅰ期组(36例)、Ⅱ期组(37例)、Ⅲ期组(35例)及Ⅳ期组(42例)4个亚组。纳入标准:(1)经组织病理学检测确诊为胃癌;(2)外周血提取前未进行手术、放化疗及免疫治疗;(3)精神状态正常;(4)临床病历资料完整;(5)心、肺、肝、肾等重要器官功能正常。排除标准:(1)伴有其他恶性肿瘤;(2)伴有其他严重内科疾病;(3)伴有其他消化系统疾病;(4)具有影响本研究药物服用史;(5)中途退出研究。

1.2方法 采集所有研究对象5 mL外周空腹静脉血,离心10 min(速度为3 000 r/min,半径为10 cm),得到上层血清,置于-70 ℃环境下保存待检。胃癌组织采集:切取所有患者经病理证实的病变组织、肉眼观察距离病变组织5 cm的癌旁组织及正常组织,将收集到的组织标本分为两部分,一部分采用10%甲醛溶液固定保存,另一部分立即投入液氮冷冻,置于-80 ℃环境下保存。良性病变组织采集:通过传统手术进行胃部分切除,取部分胃部的病灶活组织作为病理活检标本,保存待检,检测方法同胃癌组织。circRNA检测:依据Trizol试剂说明书提取血清总RNA,RNA纯度依据紫外分光光度计进行检测,选取吸光度用于后续试验,将RNA反转录为互补DNA(cDNA),反转录试剂盒购自北京启衡星生物科技有限公司,货号为K1622,Trizol试剂盒购自美国ABI公司,同时采用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)方法对所有研究对象的circRNA表达水平进行检测,PCR扩增条件为95 ℃、15 s,62 ℃、30 s,72 ℃、45 s,45个循环,采用2-ΔΔct方法对circRNA水平进行相对定量。Notch-3检测:固定标本选用10%中性甲醛,对其进行常规脱水、透明及免疫组化染色等操作,试剂盒购自北京博奥森生物试剂公司,货号为HB-T2177。采用qRT-PCR进行RNA提取及反转录为cDNA,上游引物序列为5′-CTACGACTGTGTCTGCCAACCTG-3′,下游引物序列为5′-GCTGGAAGCACACTCATTGATCTC-3′。胃蛋白酶检测:采用酶联免疫吸附试验(芬兰Biohit公司试剂盒,货号为M20220)对胃蛋白酶水平进行测定。所有操作均由本院经验丰富的2名专业医师严格按照说明书进行。

2 结 果

2.1研究组和良性组circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平对比 研究组circRNA、Notch-3及胃蛋白酶表达水平较良性组高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1～2。

注：A为胃部良性病变组织中circRNA的表达;B为胃部良性病变组织中Notch-3的表达;C为胃部良性病变组织中胃蛋白酶的表达。

注：A为胃癌组织中circRNA的表达;B为胃癌组织中Notch-3的表达;C为胃癌组织中胃蛋白酶的表达。

表1 研究组和良性组患者circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平对比

2.24组circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平对比 circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平比较,Ⅰ期组<Ⅱ期组<Ⅲ期组<Ⅳ期组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组circRNA、Notch-3及胃蛋白酶的表达水平对比

2.3circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独及联合检测对胃癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独检测胃癌的曲线下面积(AUC)分别为0.797、0.802、0.848,低于3项指标联合检测的0.901(Z=10.799、11.231、14.492,P<0.05)。见表3、图3。

图3 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独及联合检测诊断胃癌的ROC曲线

表3 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独及联合检测对胃癌的诊断价值

2.4circRNA、Notch-3、胃蛋白酶与胃癌分期的相关性 circRNA、Notch-3、胃蛋白酶均与胃癌分期呈正相关(r=0.585、0.581、0.645,P<0.05)。

3 讨 论

我国胃癌发病率呈逐年上升趋势,但现阶段并没有一种很好的方式预防胃癌的发生,临床研究显示,胃癌与遗传、分子标志物、感染及癌前病变等均有一定联系,属于多因素综合作用导致的一种疾病[11-12]。现如今胃癌发病机制并未统一,分析可能与幽门螺杆菌感染及长期胃部慢性良性疾病等有关,其早期临床表现不明确,容易与其他胃部良性疾病混淆,可能会出现漏诊、误诊现象,若不及时进行干预,则会发展为更加严重的胃癌,提高患者病死率,因此尽早寻找诊断胃癌的灵敏标志物是胃癌患者有效诊治的关键[13-14]。

胃癌是由多因素导致的癌细胞大量增殖及凋亡受到抑制的结果;circRNA属于共价闭合环状的新型非编码RNA分子,随着医疗水平不断进步,circRNA被发现广泛存在于人体,且在不同病变组织中具有特异性表达[15]。Notch属于一种高度保守由基因编码的异二聚体组成的跨膜蛋白质,对细胞分化具有重要意义,由跨膜区、表皮生长因子、富含半胱氨酸样重复序列的胞外区组成。人体中共包含Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4 4个同源体,其中Notch-3可以促进肿瘤干细胞分化[16-17]。胃蛋白酶可以间接反映同部位胃黏膜腺体的组织状态及胃黏膜特异性功能酶水平,在胃癌早期诊断及预后中具有重要应用价值[18-19]。本研究结果显示,研究组circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表达水平较良性组更高,Ⅳ期组circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表达水平较Ⅰ期组、Ⅱ期组及Ⅲ期组更高,差异均有统计学意义(P<0.05),此外circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表达水平与胃癌分期均呈正相关(r=0.585、0.581、0.645,P<0.05)。这提示circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表达水平在不同胃癌分期患者中均有异常表达。其原因可能是circRNA具有微小RNA(miRNA)分子海绵作用,参与RNA结合蛋白及多种病理过程,circRNA表达水平越高,胃癌越严重,且circRNA可以影响信使RNA(mRNA)的稳定性并调节其在细胞内的表达,主要是通过与mRNA的3′非翻译区结合完成。胃癌细胞侵袭转移阶段circRNA表达水平上升会促进胃癌迁移[20]。Notch-3信号转导通路中Notch-3受体的基因表达水平与胃癌的发生及发展具有紧密联系,Notch-3可以在胃癌组织中保持高增殖低分化状态,并且其增殖能力也随胃癌的不断发展而不断提升,胃癌的发生、发展会加速体外转化细胞中Notch-3的分泌,并且可以发挥体内异种移植模型的药理作用,进一步加快肿瘤发展[21-24]。胃蛋白酶表达水平在胃黏膜出现损伤时会发生相应变化,同时可以体现出胃体黏膜泌酸作用,胃黏膜出现损伤后,其表达水平会显著上升,造成肿瘤细胞分化程度较差,成熟细胞功能保留较少,淋巴结转移较多,肿瘤侵袭能力较强,影响患者预后。circRNA、Notch-3、胃蛋白酶表达水平随胃癌加重其表达水平不断升高,与胃癌分期呈正相关。

本研究显示,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独及联合检测对胃癌具有一定的诊断价值,其中3项指标联合检测的诊断的AUC更高,为0.901,这提示circRNA、Notch-3、胃蛋白酶均可作为早期筛选胃癌的生物标志物,3项指标联合检测的诊断效能更优。

综上所述,circRNA、Notch-3、胃蛋白酶在胃癌及胃癌不同分期中均有异常表达,且circRNA、Notch-3、胃蛋白酶单独及联合检测对胃癌具有一定诊断价值,3项指标联合检测的AUC更高,可作为临床诊断胃癌的特异性指标。但本研究样本量较少,可能使结果存在一定偏倚,后续还需进行样本量更大的研究为临床诊断胃癌提供参考。