基于网络药理学和实验验证探讨藤黄酸抑制膀胱癌的作用及机制

陈瑞琦，熊洪，刘宏伟（广东医科大学附属医院泌尿外科研究室，广东 湛江 524001）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，是世界上第十大常见癌症[1]。数据显示，近年来我国膀胱癌的总发病率呈上升趋势[2]。膀胱癌根据其浸润深度可分为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC）和非肌层浸润性膀胱癌（non muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）[3]。现阶段，新辅助化疗联合根治性膀胱切除术是目前治疗MIBC的标准方案，然而部分无法接受手术的患者只能采用化疗、放疗等方法，在治疗过程中会出现较大的不良反应[4]。经尿道膀胱肿瘤切除术联合术后膀胱灌注化疗或免疫治疗是NMIBC的常规治疗方案之一，但是治疗效果有限，具有很高的复发率[5]。因此，有必要寻找具有更好疗效且不良反应较小的治疗膀胱癌的潜在药物。

研究发现，中药在抗肿瘤方面具有多靶点、不良反应小、不易产生耐药性等特点[6]。藤黄是藤黄科植物藤黄（GarciniahanburyiHook.F.）分泌出的树脂，具有治疗痈疽、损伤出血、牙疳蛀齿等作用[7]。藤黄酸（gambogic acid，GA）是从藤黄中提取的主要化合物之一，具有抗氧化、抗炎等多种功能。研究发现，GA可抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进其凋亡[8]。网络药理学是建立在药物-基因-疾病的多层次网络基础上的新兴学科，可以从整体上预测药物的作用靶点[9]。本研究通过网络药理学筛选GA抑制膀胱癌的潜在作用靶点，通过细胞实验验证，探讨GA抑制膀胱癌的作用及可能机制，为筛选出膀胱癌的潜在辅助治疗药物提供理论基础。

1 材料

1.1 数据库与软件

PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库，PharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）数据库，UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库，GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库，STRING（https：//cn.string-db.org/），David（https：//david.ncifcrf.gov）数据库，数据分析软件Cytoscape 3.9.1，在线网站Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），在线网站微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）。

1.2 材料

人膀胱癌UM-UC-3细胞（中科院上海细胞库），DMEM培养基（货号：C11995500BT）、胰蛋白酶（货号：25200072）（美国 Gibco 公司），藤黄酸（成都植标化纯生物技术有限公司，货号：PCS0866），Annexin V-FITC凋亡分析试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），胎牛血清（货号：Z7185FBS-500）、ECL-Western blot化学发光液（货号：310208）（美国 Zeta Life 公司），PI3 Kinase（PI3K）兔多克隆抗体、AKT 鼠单克隆抗体、Phospho-AKT（p-AKT）鼠单克隆抗体（美国Proteintech公司），Phospho-PI3 Kinase（p-PI3K）兔多克隆抗体（美国GeneTex公司），Cell counting Kit-8试剂盒（日本同仁化学研究所），Transwell小室（美国Corning公司），基质胶（广州市沃德生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 获取GA的作用靶点

在PubChem数据库以“gambogic acid”为关键词获取GA 的3D结构式的sdf文件，将文件上传至 PharmMapper 数据库，得到GA作用靶点，再将靶点上传至 UniProt 数据库，通过ID mapping匹配靶点的基因名称。

2.2 获取膀胱癌的靶基因

以 “bladder cancer”为关键词，在GeneCards数据库检索膀胱癌的相关靶基因。

2.3 获取GA抑制膀胱癌的潜在靶基因

通过在线网站 Venny 2.1.0，取前两步获取的GA作用靶点和膀胱癌相关靶基因的交集，得到GA抑制膀胱癌的潜在靶基因。

2.4 蛋白互作网络构建

将GA抑制膀胱癌的潜在靶基因上传至 STRING数据库，设置物种为“Homo sapiens”，最低互动分数要求＞0.400，隐藏网络中断开的节点，并将tsv数据文件导入Cytoscape 3.9.1分析，通过Betweeness Centrality算法得到潜在靶基因的中介中心性。

2.5 GO和KEGG分析

将得到的中介中心性最高的20个潜在靶基因上传至 DAVID 数据库，限制物种为“Homo sapiens”，选择GO 生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF），KEGG 通路进行分析，将所得结果通过在线网站微生信进行可视化处理。

2.6 GA溶液的制备

将GA粉末配制成1000 μmol·L－1的GA水溶液，避光储存于－20℃冰箱，实验时稀释成实验所需浓度。

2.7 细胞培养和分组

将UM-UC-3细胞接种于培养皿，使用DMEM完全培养基（10%浓度胎牛血清），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞生长至80%以上时传代。实验时按照GA药物浓度（0、40、80、160 μmol·L－1）分为4组，0 μmol·L－1组为对照组。

2.8 CCK-8实验

取对数生长期UM-UC-3细胞，接种于96孔板，每孔3×103个细胞，置于细胞培养箱中培养，24 h后弃旧培养基，分别加入含有不同浓度GA的培养基，每组设置3个复孔，继续培养24、48、72 h，取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，避光孵育2 h后检测各孔在 450 nm 波长处的光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（对照组OD值－实验组OD值）/对照组OD值×100%。

2.9 细胞克隆形成实验

取对数生长期UM-UC-3细胞，以每孔1×103个细胞接种于6孔板，24 h后弃旧培养基，分别加入含有不同浓度GA的培养基，10 d后弃培养基，用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色，冲洗、晾干后拍照，计算克隆形成数目。

2.10 细胞划痕实验

取对数生长期UM-UC-3细胞，接种于6孔板，待细胞生长浓度超过90%后用200 μL规格的移液枪头划痕，弃旧培养基，分别加入含有不同浓度GA的培养基，显微镜下随机选取3个视野拍照，继续培养24 h后取出，在相同位置拍照，用Image J软件测量划痕面积，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）＝（0 h划痕面积－24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

2.11 Transwell迁移实验

取对数生长期UM-UC-3细胞，接种于6孔板，待细胞完全贴壁后弃旧培养基，分别加入含有不同浓度GA的培养基，24 h后弃培养基，胰蛋白酶消化后用不含血清的DMEM培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度，取200 μL细胞悬液（含4×104个细胞）加入上室，下室加入600 μL DMEM完全培养基，继续培养24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色，冲洗、晾干后随机选取3个视野拍照，计算细胞迁移数。

2.12 Transwell侵袭实验

用无血清DMEM培养基按8∶1的比例稀释基质胶，取50 μL稀释后的基质胶铺于Transwell小室并放入培养箱，待基质胶凝固后取出，其余步骤同“2.1.1”项下Transwell 迁移实验。

2.13 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期UM-UC-3细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后弃旧培养基，分别加入含有不同浓度GA的培养基，继续培养24 h后取出，收集培养基和贴壁细胞，重悬，取1×106个细胞，PBS清洗，离心后弃PBS，使用195 μL Annexin V-FITC结合缓冲液制成细胞悬液并移入流式管，分别加入5 μL Annexin V和10 μL PI，避光孵育20 min，使用流式细胞仪分析。

2.14 Western blot 实验

取对数生长期UM-UC-3细胞接种于培养皿，分别加入含有不同浓度GA的培养基，继续培养24 h后弃培养基，PBS清洗，提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度，加热变性，置于－20℃冰箱保存。SDSPAGE凝胶配制试剂盒配置凝胶，每孔上样30 μg，经电泳、电转、封闭、切膜后加入对应一抗（GAPDH 1∶10 000，FoxO1 1∶2000，AKT 1∶2000，p-AKT 1∶2000，PI3K 1∶500，p-PI3K 1∶500），置于4℃冰箱孵育过夜。次日取出条带，洗膜3次后分别加入对应二抗，孵育1 h，洗膜3次，化学发光法曝光成像，Image J软件统计分析蛋白相对表达水平。

2.15 统计学分析

使用 SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，实验数据以均数±标准差表示，两组均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 GA抑制膀胱癌的潜在靶点

通过PubChem获得GA的3D结构式（见图1），通过PharmMapper数据库和UniProt数据库获得有效靶点219个；通过GeneCards数据库获取膀胱癌相关基因11 618个。将两者上传至Venny 2.1.0，取交集，得到GA抑制膀胱癌的潜在靶点57个。

图1 藤黄酸的3D结构式Fig 1 3D structural formula of gambogic acid

3.2 蛋白互作网络构建和核心靶点分析

通过使用STRING数据库，得到GA抑制膀胱癌潜在靶点的蛋白互作图（见图2），其中节点数量55个，边数60条，平均节点度2.18，平均局部聚类系数为0.416，蛋白互作富集P值为0.007 48。Betweeness Centrality算法得到中介中心性最高的20个靶点，见表1。

表1 藤黄酸抑制膀胱癌的潜在靶点(前20)Tab 1 Potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid (Top 20)

图2 藤黄酸抑制膀胱癌的潜在靶点的蛋白互作图Fig 2 Protein-protein interaction diagram of the potential targets of inhibition of bladder cancer induced by gambogic acid

3.3 GO和KEGG分析

将中介中心性最高的20个靶点进行GO和KEGG通路富集分析，得到GO分析条目66条，其中包括维持中性粒细胞内稳态等26个BP；囊泡膜等17个CC；参与氧气转运等28个MF，见图3；KEGG 通路富集分析显示GA抑制膀胱癌可能与PI3K/AKT、FoxO1、HIF-1等信号通路相关，见图4。通过查阅文献得知FoxO1作为FoxO家族的成员可以抑制膀胱癌，故后续选择FoxO1进行验证。

图3 藤黄酸抑制膀胱癌的20个潜在靶基因的GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

图4 藤黄酸抑制膀胱癌的20个潜在靶基因的KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of 20 potential target genes which inhibit bladder cancer by gambogic acid

3.4 GA抑制UM-UC-3细胞的增殖能力

CCK-8实验结果显示，GA处理24 h后，与对照组相比，各实验组UM-UC-3细胞的增殖均受到抑制，见表2；细胞克隆形成实验结果显示，与对照组相比，各实验组的克隆形成数目均降低，见图5。提示GA可抑制UM-UC-3细胞的增殖能力。

表2 藤黄酸对UM-UC-3细胞增殖能力的影响(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

表2 藤黄酸对UM-UC-3细胞增殖能力的影响(±s，n＝3)Tab 2 Effect of gambogic acid on the proliferation ability of UM-UC-3 cells (±s，n＝3)

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

组别药物作用时间OD值增殖抑制率/%对照组GA 40 μmol·L－1组GA 80 μmol·L－1组GA 160 μmol·L－1组24 h1.64±0.11－24 h1.43±0.08*13.79±1.23 24 h1.30±0.12**21.52±2.79 24 h1.08±0.05***36.92±3.40对照组GA 40 μmol·L－1组GA 80 μmol·L－1组GA 160 μmol·L－1组48 h3.46±0.02－48 h2.59±0.04***22.67±3.52 48 h2.11±0.10***37.01±2.41 48 h1.42±0.18***55.05±0.94 72 h4.22±0.08－72 h2.59±0.05***38.54±0.61 72 h1.98±0.05***53.09±2.12 72 h1.44±0.01***65.76±0.47对照组GA 40 μmol·L－1组GA 80 μmol·L－1组GA 160 μmol·L－1组

图5 藤黄酸对UM-UC-3细胞克隆形成能力的影响Fig 5 Effect of gambogic acid on the colony formation of UM-UC-3 cells

3.5 GA抑制UM-UC-3细胞的迁移和侵袭能力

细胞划痕实验结果显示，GA处理24 h后，与对照组相比，各实验组UM-UC-3细胞的划痕愈合面积降低，见图6；Transwell实验结果显示，GA处理24 h后，与对照组相比，各实验组UMUC-3细胞的迁移和侵袭数均降低，见图7。提示GA抑制UM-UC-3细胞的迁移和侵袭能力。

图6 藤黄酸对UM-UC-3细胞迁移能力的影响（×200）Fig 6 Effect of gambogic acid on the migration of UM-UC-3 cells（×200）

图7 藤黄酸对UM-UC-3细胞迁移和侵袭能力的影响（×200）Fig 7 Effect of gambogic acid on the migration and invasion ability of UM-UC-3 cells（×200）

3.6 GA促进UM-UC-3细胞的凋亡

细胞凋亡检测实验结果显示，GA处理24 h后，与对照组相比，各实验组UM-UC-3细胞的凋亡率均增加，见图8。提示GA可促进UM-UC-3细胞的凋亡。

图8 藤黄酸对UM-UC-3细胞凋亡的影响Fig 8 Effect of gambogic acid on the apoptosis of UM-UC-3 cells

3.7 GA调控UM-UC-3细胞PI3K/AKT/FoxO1信号通路的表达

Western blot 实验结果显示，GA处理24 h后，与对照组相比，各实验组UM-UC-3细胞的AKT蛋白表达水平未见变化，PI3K、p-PI3K均下调，FoxO1表达量上调；与对照组相比，GA 80、160 μmol·L－1组 UM-UC-3细胞的p-AKT表达量下调，见图9。提示GA可以下调PI3K、p-PI3K、p-AKT的表达，上调FoxO1的表达。

图9 藤黄酸对UM-UC-3细胞PI3K/AKT/FoxO1信号通路相关蛋白表达的影响Fig 9 Effect of gambogic acid on the expression of PI3K/AKT/FoxO1 signaling pathway-related proteins in UM-UC-3 cells

4 讨论

研究表明，中药可以直接抑制肿瘤的进展，也能减少化疗、放疗引起的不良反应，目前已经被广泛运用于肿瘤的辅助治疗上，具有一定的疗效[10]。GA是近年的研究热点之一，有多项研究发现GA具有抗肿瘤作用。例如GA以剂量依赖的方式抑制前列腺癌细胞的增殖能力，并诱导其凋亡[11]。此外，GA可以抑制结肠癌HCT116和CT26细胞的增殖、迁移和侵袭，并引发抗肿瘤免疫反应[12]。本研究发现，与对照组相比，GA处理后UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力均下降，提示GA可以抑制UM-UC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力；流式细胞术结果显示，GA处理后UM-UC-3细胞的凋亡率高于对照组，提示GA可以促进UM-UC-3细胞的凋亡。

本研究通过网络药理学分析，筛选出57个GA抑制膀胱癌的潜在靶点，其中EP300和NOS2是中介中心性最高的两个靶点。研究表明，EP300在膀胱癌中易发生突变，引起抗肿瘤免疫反应[13]。NOS2已被证明在多种癌症中高表达，并且可作为癌症预后的不良预测因子[14]。KEGG通路富集分析显示GA抑制膀胱癌与PI3K/AKT、HIF-1和FoxO1信号通路具有较高相关性。HIF-1是一个在生物体代谢过程中起关键作用的调节因子，在多种良性或恶性肿瘤的表达均上调[15]。FoxO是一个可调节多种生物过程的转录因子，在细胞的衰老、凋亡、分化、DNA损伤修复等方面都能发挥功能，并且具有抑癌作用[16]。PI3K/AKT信号通路是细胞内最重要的信号通路之一，参与多种细胞功能；但PI3K/AKT信号通路在癌症的发展过程中往往会过度激活，促进癌症的发展[17]。研究发现，FoxO转录因子在多种癌症的发展过程中会作为PI3K/AKT信号通路的下游靶点而受到抑制[18]。例如PI3K/AKT信号通路通过抑制FoxO1的磷酸化，调控hnRNP-F蛋白的表达，进而促进膀胱癌的增殖[19]。因此，本研究选择PI3K/AKT/FoxO1通路，通过Western blot进行验证，结果显示GA可以下调PI3K、p-PI3K、p-AKT的表达，并上调FoxO1的表达，所以推测GA抑制膀胱癌的作用可能和PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。

综上所述，本研究基于网络药理学及细胞实验方法，探讨了GA抑制膀胱癌的作用及可能机制。研究表明，GA可以抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进其凋亡；其机制可能与调控PI3K/AKT/FoxO1信号通路有关。但本研究存在一定的不足之处，研究机制不够深入，后续需通过挽救实验及动物实验进一步验证。