miR-20a-5p调控NFKBIB对人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤增殖的影响

王雅琦 李万富 阿依古再丽·麦麦江 艾尼娃·克然木 樊珈榕 梁鹏 娜菲沙·沙木西丁

新疆医科大学第一附属医院小儿普外科 （乌鲁木齐 830000）

肾母细胞瘤（Wilms tumor，WT）是儿童最常见的恶性肾肿瘤［1-2］。经过大型多中心研究，WT患儿的总生存率已达到90%［3］，但仍存在预后不佳的亚组［4］。因此目前关于WT的研究目标已转变为优化风险分类，制定个体化治疗策略［3，5］。miRNAs是一类具有调控功能的非编码RNA，已被证明可以调节肾脏形态的发生［6］。如部分WT患儿表现出miRNA有害突变［7-8］。免疫反应调节因子NF-κB与癌症密切相关［9］。目前已经发现一些miRNA可以调节NF-κB的激活［10-11］。NF-κB转录因子抑制蛋白NFKBIB（IκBβ）可以阻碍NF-κB的激活［12］。但miRNA通过调控NFKBIB影响NF-κB通路激活方面还少见报道，为此，我们前期通过体外实验得到miR-20a-5p在人肾母细胞瘤细胞系WiT49中高表达，且miR-20a-5p可能是通过调控NFKBIB激活NF-κB通路促进WiT49细胞功能。本研究经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会审批（伦理审批号：K202309-32），拟通过生物信息学分析验证miR-20a-5p在人肾母细胞瘤中高表达，并通过动物实验进一步验证在裸鼠体内miR-20a-5p表达水平对WiT49移植瘤的生长影响以及作用机制，为肾母细胞瘤的诊疗及预后预测寻找新的生物标志物，指导临床个体化治疗。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系及实验动物人胚肾细胞293T及人肾母细胞瘤细胞系WiT49购自武汉普诺赛生命科技有限公司；BALB/c Nude小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂与耗材胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，miR-20a-5p过表达及干扰慢病毒载体购自上海吉凯基因科技有限公司（上海，中国），双荧光素酶报告系统试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司，盐酸塞拉嗪注射液购自吉林省华牧动物保健品有限公司，细胞RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，逆转录和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB引物购自上海生工生物工程有限公司（上海，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 差异基因及共表达分析从GEO公共数据库下载基因表达芯片，获取正常肾组织样本及肾母细胞瘤组织样本的miRNA测序数据，使用GEO2R在线分析工具进行差异分析，取adj.P＜0.05且|logFC| ≥ 1为差异miRNA；通过cBioPortal数据库获得共表达基因，Spearman相关性分析R值为0～0.3代表弱或者不相关；0.3～0.5代表弱相关；0.5～0.8代表中等程度相关；0.8～1代表强相关。

1.2.2 双荧光素酶酶实验通过targetscan数据库预测差异miRNA靶基因；通过双荧光素酶实验验证，将用于转染的人胚肾细胞293T细胞放入96孔板中，待细胞密度达到50%～70%，将培养基与目的质粒以及目标基因充分混匀后室温放置（溶液A），之后将培养基与转染试剂充分混匀放置（溶液B），将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min，将转染混合物加入96孔板混匀，37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养48 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告系统试剂盒试剂盒进行检测。

1.2.3 细胞培养人肾母细胞瘤细胞系WiT49用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，并在培养液中加入1%的青霉素和链霉素。在37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养，待细胞密度达80%～90%时，按比例用胰蛋白酶消化液（0.25% EDTA）消化后传代。

1.2.4 慢病毒转染将细胞以2 × 105/孔铺到6孔板中，待细胞密度达80%～90%，按照慢病毒产品手册，在6孔板中按照miR-20a-5p过表达组滴度：3E+8，miR-20a-5p低表达组滴度：5E+8加入病毒悬液，在37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养，显微镜观察荧光蛋白，转染效率达80%时使用6 μg/mL嘌呤霉素筛选稳度表达细胞系。

1.2.5 裸鼠成瘤实验

1.2.5.1 实验分组选取4～6周龄，体质量（20±2）g的SPF级雌性裸小鼠12 只，饲养于新疆医科大学动物实验中心。饲养温度（23±3）℃，相对湿度40%～70%。经适应性饲养后均分为3组：WiT49模型组（4只）、WiT49-miR-20a-5p过表达组（4只）、WiT49-miR-20a-5p敲低组（4只）。

1.2.5.2 实验步骤

1.2.5.2.1麻醉剂配制按舒泰65 mg/kg+盐酸赛拉嗪10 mg/kg溶于灭菌注射用水中，浓度及剂量按照动物实际体质量计算。

1.2.5.2.2 模型建立取各组稳定表达的WiT49细胞，制成5 × 106·mL-1的细胞悬液，再与基质胶1∶1混合均匀，分别向各组裸鼠右侧腋窝皮下注射200 mL的细胞混合液。

1.2.5.2.3 造模后观察指标见瘤后，每4天测量各组裸鼠体质量，用游标卡尺测量裸鼠的皮下瘤块直径并拍照留图。待瘤块平均直径超过20 mm取血、处死，取其完整瘤块组织，游标卡尺测量瘤块体积及重量。

1.2.5.2.4 样本收集血清样本：各组裸鼠麻醉，摘眼球取血1 mL左右，在4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液单独分装，保存于-80 ℃。瘤块组织：各组裸鼠处死，取完整瘤块组织，先对瘤块拍照，测量体积并称重后直接液氮速冻，保存于-80 ℃。

1.2.6 总RNA提取和qRT⁃PCR检测按RNA试剂盒说明书提取瘤块组织总RNA，检测其浓度，按照逆转录试剂盒说明书操作得到cDNA。分别配置miRNA及mRNA荧光定量PCR反应体系，对miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB进行qRT-PCR扩增检测，内参为mouse-actin。按照qRT-PCR试剂盒说明书操作。用2-ΔΔCt法计算各组细胞中基因的相对表达量。

1.2.7 CCK⁃8细胞增殖实验制备各组细胞悬液并计数后接种在96孔细胞培养板中（1 × 104个细胞/μL/100孔），37 ℃，5% CO2恒温恒湿培养箱分别培养0、24、48、72 h。每孔加10 μL CCK-8试剂，过程注意避光操作，继续培养2 h后用酶标仪测定在450 nm的吸光度，反应细胞增殖能力。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0统计软件进行分析，并使用GraphPad Prism 8软件绘制图片。符合正态分布的数据用（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较进行单因素方差分析，相关性分析采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃20a⁃5p在肾母细胞瘤中高表达，且与NF⁃κB表达呈正相关对比正常肾组织样本及肾母细胞瘤组织样本的miRNA测序数据，经过筛选得到21个上调基因和22个下调基因，使用omicshare绘制热图（图 1），通过cBioPortal数据库获得与上调基因miR-20a-5p表达相关的NF-κB（r= 0.745，P＜0.001）。

2.2 双荧光素酶实验结果显示miR⁃20a⁃5p与NFKBIB存在结合作用通过targetscan数据库预测NFKBIB与miR-20a-5p具有相互结合位点；荧光素酶报告实验结果表明，miR-20a-5p过表达对照组、miR-20a-5p过表达组的突变型3'-UTR荧光素酶活性为0.99±0.08、1.01±0.06，miR-20a-5p过表达对照组、miR-20a-5p过表达组的野生型3'-UTR荧光素酶活性为1.00±0.06、0.44±0.39，miR-20a-5p过表达组与过表达对照组的野生型荧光素酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.000 1）；miR-20a-5p过表达组与过表达对照组的突变型荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P= 0.539 9）。

2.3 裸鼠成瘤实验显示miR⁃20a⁃5p过表达促进人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤生长裸鼠成瘤实验，造模第7天见瘤，造模第11天瘤块平均直径超过20 mm（图2）。造模第11天（处死前）WiT49-miR-20a-5p过表达组裸鼠体质量高于WiT49模型组，差异有统计学意义（P= 0.011）；WiT49-miR-20a-5p敲低组裸鼠体质量与WiT49模型组差异无统计学意义（P= 0.863）。裸鼠处死后，WiT49-miR-20a-5p过表达组瘤块体积及重量高于WiT49模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），WiT49-miR-20a-5p敲低组瘤块体积及重量与WiT49模型组差异无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

图1 正常肾组织和肾母细胞瘤组织之间差异miRNA热图Fig.1 Differentially expressed miRNAs heat maps between normal and Wilms' tumor tissues

图2 各组裸鼠造模第11天瘤块直径Fig.2 The diameter of the tumor was 11 days in each group

2.4 qRT⁃PCR检测各组裸鼠瘤块结果显示miR⁃20a⁃5p与NF⁃κB表达呈正相关，与NFKBIB表达呈负相关WiT49-miR-20a-5p过表达组瘤块中miR-20a-5p及NF-κB表达高于WiT49模型组，NFKBIB表达低于WiT49模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），WiT49-miR-20a-5p敲低组瘤块中miR-20a-5p及NF-κB表达低于WiT49模型组，NFKBIB表达高于WiT49模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2），各组瘤块中miR-20a-5p与NF-κB表达呈正相关（r= 0.933，P＜0.001），与NFKBIB表达呈负相关（r= -0.883，P= 0.003）。

2.5 CCK-8细胞增殖实验提示miR-20a-5p过表达促进人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤细胞增殖0 h转染各组WIT49细胞吸光度值差异无统计学意义（P＞0.05），24、48 h WiT49-miR-20a-5p过表达组细胞吸光度值高于WiT49模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），72 h细胞吸光度值差异无统计学意义（P＞0.05）；24、48、72 h WiT49-miR-20a-5p敲低组细胞吸光度值均低于WiT49模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 3）。

表1 裸鼠处死前体质量、处死后瘤块体积及重量Tab.1 Nude mice to death before the body weight，tumor volume and weight after death ±s

表1 裸鼠处死前体质量、处死后瘤块体积及重量Tab.1 Nude mice to death before the body weight，tumor volume and weight after death ±s

注：与WiT49模型组比较，*P＜0.05

项目裸鼠体质量（g）瘤块体积（mm3）瘤块重量（g）WiT49-miR-20a-5p敲低组20.40±1.64 1 444.05±1 207.95 1.16±0.80 WiT49模型组20.28±1.48 2 042.00±391.00 1.52±0.32 WiT49-miR-20a-5p过表达组22.65±1.46*3 375.50±838.50*2.80±0.57*

表2 qRT-PCR检测各组瘤块中miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB表达水平Tab.2 The expression levels of miR-20a-5p，NFKBIB and NF-κB in tumor masses were detected by qRT-PCR ±s

表2 qRT-PCR检测各组瘤块中miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB表达水平Tab.2 The expression levels of miR-20a-5p，NFKBIB and NF-κB in tumor masses were detected by qRT-PCR ±s

注：与WiT49模型组比较，*P＜0.05

项目miR-20a-5p NFKBIB NF-κB WiT49-miR-20a-5p敲低组0.50±0.44*1.90±0.87*0.71±0.29*WiT49模型组1.01±0.47 1.01±0.48 1.02±0.15 WiT49-miR-20a-5p过表达组2.00±0.51*0.49±0.19*1.35±0.23*

表3 CCK-8细胞增殖实验检测各组WiT49细胞不同时间点细胞增殖情况Tab.3 CCK-8 cell proliferation assay was used to detect the proliferation of WiT49 cells in each group at different time points ±s

表3 CCK-8细胞增殖实验检测各组WiT49细胞不同时间点细胞增殖情况Tab.3 CCK-8 cell proliferation assay was used to detect the proliferation of WiT49 cells in each group at different time points ±s

注：与WiT49模型组比较，*P＜0.05

时间0 h 24 h 48 h 72 h WiT49-miR-20a-5p敲低组0.01±0.00 0.04±0.01*0.62±0.03*1.76±0.15*WiT49模型组0.01±0.00 0.28±0.01 0.89±0.21 2.83±0.01 WiT49-miR-20a-5p过表达组0.01±0.00 0.96±0.35*1.69±0.33*2.83±0.19

3 讨论

WT是一种儿童胚胎性肿瘤［13］，起源于异常的肾形成，由于多学科协作的进展，WT患者的总体预后良好，但仍存在预后较差、复发率较高的亚组［14］。既往，儿童肿瘤协作组（COG）提出根据1p和16q位点的杂合性缺失对肿瘤进行分层，1p和16q染色体上的等位基因缺失或1q的增加等特征代表着临床的高侵袭性，但这很难为WT靶向治疗提供帮助［15］。有研究［16］利用WT的全基因组和全外显子组测序发现了miRNA上的新突变。如miR-483-3p可通过失活PTEN、激活AKT信号通路对WT细胞起促进作用，下调miR-483-3p可提高WT对阿霉素治疗的敏感性，抑制WT细胞［17］；miR-200b/c/429可通过调控NF-κB通路相关基因IKK-β抑制NF-κB通路，LINC00667可竞争性结合miR-200b/c/429调控IKK-β表达，进而激活NF-κB通路促进肾母细胞瘤的进展［18］。目前，一些基于miRNA的药物已处于临床试验中［19］。NF-κB是参与炎症和癌变的重要转录因子［20］。正常情况下，NF-κB转录因子抑制蛋白IκB在细胞质中抑制NF-κB，机体受到刺激后，活化的IκB激酶使IκB磷酸化，进而诱导IκB泛素化和降解，解除抑制的NF-κB被释放并转运到细胞核中［21］，NF-κB的持续激活有助于包括WT在内的多种肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移［22］。

本研究通过GEO数据库对比肾母细胞瘤及正常肾组织基因序列得到miR-20a-5p在肾母细胞瘤中高表达，通过Spearman相关性分析得到miR-20a-5p与NF-κB表达呈正相关，通过targetscan数据库及双荧光素酶实验得到miR-20a-5p与NFKBIB存在结合作用，裸鼠成瘤实验结果显示miR-20a-5p过表达促进人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤的生长，敲低组与模型组的裸鼠体质量、瘤块体积及重量差异无统计学意义，可能是因为WiT49恶性程度高，造模第11天瘤块平均直径就已达20 mm，为减少裸鼠痛苦，遂立刻将裸鼠处死，敲低组与模型组生长差异未完全体现。qRT-PCR检测各组裸鼠瘤块中的miR-20a-5p表达与NF-κB成正比，与NFKBIB成反比。CCK-8细胞增殖实验显示miR-20a-5p过表达促进人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤细胞增殖，72 h过表达组细胞和模型组差异无统计学意义，考虑是因为细胞增殖达96孔板生长上限。因此，结合本课题组前期体外实验研究，我们进一步验证了miR-20a-5p可能是通过调控NFKBIB激活NF-κB通路促进肾母细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭，抑制其凋亡。

此外，本课题组已有研究发现miR-20a-5p可通过NF-κB对神经母细胞瘤产生影响，这种共同信号通路背景下的讨论可能有助于增进对儿童颅外实体瘤发生、发展相关机制的理解［23］。但本研究仍缺乏临床资料验证，因此本课题组今后将收集临床样本，完善蛋白质印迹及免疫组化等实验，最终实现指导临床靶向治疗的目标。